病原性河流弧菌对青石斑鱼的粘附定植作用研究

论文摘要

河流弧菌（Vibrio fluvialis）是一种广泛分布于近岸海域的嗜盐性革兰氏阴性菌,能引起多种水产动物的疾病,并可通过污染食品引起食物中毒,引发肠胃炎等疾病。本文以病原性河流弧菌为研究对象,分别从病原菌的培养条件、生长阶段、营养状态等方面以及表皮粘液经不同方式处理后,对河流弧菌的粘附特性进行了研究。另外,还通过构建表达绿色荧光蛋白的河流弧菌,研究了其在青石斑鱼肠道内的粘附定植情况以及对青石斑鱼肠道消化酶活力的影响。本文首先采用3H-TdR同位素示踪法研究了河流弧菌对青石斑鱼体表粘液的粘附作用。试验结果显示:经TSB培养的河流弧菌对青石斑鱼表皮粘液的粘附作用极显著高于经TSA培养的河流弧菌;河流弧菌经TSB培养后能很好的粘附于青石斑鱼表皮粘液,其粘附量随菌浓度升高而增大并符合饱和粘附动力学;营养饥饿试验表明饥饿能显著抑制河流弧菌对青石斑鱼表皮粘液的粘附作用,饥饿1d,粘附量降低了69%,饥饿4d,粘附量降低了94%;河流弧菌经O抗体处理后,其粘附量下降了52%;不同生长阶段河流弧菌的粘附能力不同,细菌的粘附量先是随着培养时间的延长而增大,并在培养24h后粘附量达到最大,而后随着培养时间的延长其粘附量急剧下降。同样采用3H-TdR同位素示踪法标记河流弧菌,对青石斑鱼体表粘液进行不同方式处理后,研究了病原性河流弧菌对其体表粘液粘附特性。试验结果显示:青石斑鱼表皮粘液经40、60和80℃热处理10min后河流弧菌的粘附率出现显著性升高,而100℃处理10min则能极显著降低河流弧菌的粘附作用;蛋白酶K和胰蛋白酶处理粘液对河流弧菌的粘附作用没有显著影响,高碘酸处理则能极显著提高河流弧菌的粘附率;8种碳水化合物的葡萄糖、甘露糖、甘露醇、麦芽糖能极显著促进河流弧菌的粘附作用,乳糖、蔗糖及果糖能显著性促进河流弧菌的粘附作用,半乳糖则没有显著性影响;高浓度的细胞表面提取物能显著抑制河流弧菌的粘附作用,但较低浓度的细胞表面提取物反而有一定的促进作用;青石斑鱼表皮粘液经Sephadex G-100分离得到3个洗脱峰,河流弧菌对第一个洗脱峰的粘附作用最强。研究以pEGFP-C1质粒为模板,采用聚合酶链反应（PCR）的方法扩增EGFP cDNA序列,经中间载体pMD18-T vector连接后转化至感受态大肠杆菌Top10,并对重组质粒进行酶切鉴定和DNA测序,获得正确重组质粒并命名为pMD18-T-EGFP。用BamHⅠ和HindⅢ分别双酶切pMD18-T-EGFP和pET32a载体,低熔点琼脂糖回收EGFPcDNA和线性化pET32a两片段相连,转化感受态细胞BL21,将获得正确重组的表达型质粒命名为pET32a-EGFP。提取质粒转化至河流弧菌的感受态细胞,成功获得表达GFP的河流弧菌（EGFP-V. fluvialis）。EGFP-V. fluvialis在无抗生素压力选择情况下,连续培养4d,EGFP均可稳定表达。通过胃灌法将重组菌EGFP-V. fluvialis导入青石斑鱼消化道内,3h后在胃内容物中检出大量的EGFP-V. fluvialis,12h后EGFP-V. fluvialis开始定植于青石斑鱼的前肠和中肠,24h后定植于后肠。72h后在消化道内容物中检测不到标记菌,96h后在后肠壁检测不到标记菌。这些结果表明河流弧菌能够定植于青石斑鱼的肠道,前肠和中肠是其主要的定植部位。青石斑鱼肠道蛋白酶活性表现为前肠>中肠>后肠,河流弧菌的定植能够显著降低前肠蛋白酶活性,对中后肠蛋白酶活性影响不显著。青石斑鱼肠道脂肪酶活性表现为前、中肠低、后肠高,河流弧菌的定植能够显著降低后肠脂肪酶活性。青石斑鱼肠道淀粉酶活性表现为前肠>中肠>后肠,河流弧菌的定植能够显著降低前肠淀粉酶活性,提高中后肠淀粉酶活性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 河流弧菌
• 1.2 石斑鱼
• 1.2.1 石斑鱼养殖业的发展
• 1.2.2 石斑鱼主要病害
• 1.3 细菌粘附研究进展
• 1.3.1 细菌体外粘附方法
• 1.4 影响细菌粘附因素
• 1.4.1 温度
• 1.4.2 pH 值
• 1.4.3 起始菌浓度
• 1.4.4 离子浓度
• 1.4.5 孵育时间
• 1.4.6 碳水化合物
• 1.4.7 细菌本身活力
• 1.5 肠道细菌粘附定植
• 1.6 肠道细菌移位和细菌体内动态分布的研究进展
• 1.7 绿色荧光蛋白的研究进展
• 1.7.1 GFP 的生化性质
• 1.7.2 绿色荧光蛋白标记的优点
• 1.7.3 GFP 基因标记的方式
• 1.7.4 GFP 的应用
• 第二章 河流弧菌对青石斑鱼体表粘液粘附作用研究
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 青石斑鱼体表粘液制备
• 2.1.3 试验菌株的培养与放射性标记
• 2.1.4 标记菌的放射活性测定
• 2.1.5 体外粘附试验
• 2.1.6 数据处理
• 2.2 结果
• 2.2.1 标记菌的放射活性与菌数的关系
• 2.2.2 不同培养条件对河流弧菌粘附的影响
• 2.2.3 菌浓度对河流弧菌粘附的影响
• 2.2.4 营养饥饿对河流弧菌粘附的影响
• 2.2.5 抗体处理对河流弧菌粘附的影响
• 2.2.6 不同培养阶段对河流弧菌粘附的影响
• 2.3 讨论
• 第三章 病原性河流弧菌对青石斑鱼体表粘液粘附特性研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料与试剂
• 3.1.2 青石斑鱼体表粘液制备
• 3.1.3 试验菌株的培养与放射性标记
• 3.1.4 标记菌的放射活性测定
• 3.1.5 体外粘附试验
• 3.1.6 粘液经不同处理后河流弧菌的粘附作用测定
• 3.1.7 数据处理
• 3.2 结果
• 3.2.1 标记菌的放射活性与菌浓度的关系
• 3.2.2 粘液的不同处理对河流弧菌粘附作用的影响
• 3.3 讨论
• 第四章 增强型绿色荧光蛋白基因EGFP 原核表达质粒的构建及其在河流弧菌中表达
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料与试剂
• 4.1.2 表达绿色荧光蛋白河流弧菌的构建
• 4.1.3 重组蛋白的表达鉴定
• 4.2 结果
• 4.2.1 PCR 扩增EGFP 基因
• 4.2.2 pMD18-T-EGFP 重组质粒的构建
• 4.2.3 pET32a-EGFP-BL21 重组质粒的构建
• 4.2.4 pET32a-EGFP 质粒热击法V.fluvialis 的转化
• 4.2.5 荧光显微镜下的重组河流弧菌细胞
• 4.2.6 紫外灯下的重组河流弧菌菌落
• 4.2.7 重组菌V.fluvialis-EGFP 的稳定性
• 4.2.8 重组菌V.fluvialis-EGFP 的荧光强度
• 4.3 讨论
• 第五章 病原性河流弧菌对青石斑鱼肠道的粘附定植作用
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 青石斑鱼肠道及内容物中的细菌数量
• 5.2.2 青石斑鱼肠道脂肪酶活力
• 5.3 讨论
• 第六章 小结与展望
• 6.1 小结
• 6.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 在学期间发表的学术论文目录