论文摘要
果蝇幼虫巨大致死基因（lgl）表达缺失可导致大脑半球瘤性转变,成虫盘丧失其上皮细胞单层结构及生长成大量类似哺乳动物癌的无定型肿块。紧接着将其移植到野生型受体,这些肿瘤组织与哺乳动物转移癌组织的特性一样,可继续生长,并发生远处转移。lgl诱导的转移灶过度表达Ⅳ型胶原蛋白酶和NDP激酶,显现了某些人转移肿瘤的生化特性。lgl的同源物已证实存在于许多物种中:包括人、鼠、昆虫、蠕虫、黏液菌和酵母等。的确,通过果蝇lgl基因的人同源基因（Hugl-1）拯救果蝇lgl基因的突变及通过人和果蝇蛋白拯救其酵母同源基因突变的互补作用,证实了lgl基因的保守性。人基因Hugl-1（Llg/Lgl1）与果蝇肿瘤抑癌基因lethal（2） giant larvae（lgl）高度同源,Hugl-1基因位于人的17号染色体短臂近着丝点区,17p11.2-12。lgl基因编码皮层细胞骨架蛋白,并且lgl与维持细胞极性和上皮细胞的完整性有关。但迄今为止,Hugl-1在人肿瘤中的作用仍不清楚,是否Hugl表达的缺失在人肿瘤发生中起作用尚未得到广泛的研究。鉴于以上原因,本实验拟研究Hugl-1基因在结直肠癌中的表达情况,通过结直肠癌细胞株LS174构建能够稳定表达外源基因Hugl-1的结直肠癌细胞系,在此基础上,观察Hugl-1基因转染对LS174细胞体外生长的抑制作用并探讨其可能机理,为结直肠癌的基因诊断和治疗提供新的思路和理论依据。第一部分Hugl-1在人结直肠癌组织中的表达及其临床病理意义目的:研究Hugl-1在人结直肠癌中的表达情况及其与临床病理特征的相关性,以初步探讨Hugl-1在人结直肠癌中表达的生物学意义。方法:63例新鲜结直肠癌及对应癌旁正常组织标本,采用RT-PCR和Western-blot法检测Hugl-1基因mRNA和蛋白的表达。结合临床病理资料对实验结果统计分析,探寻Hugl-1基因在人结直肠癌中表达的临床意义。结果:（1）RT-PCR显示结直肠癌组织中Hugl-1mRNA表达水平低于癌旁组织,癌与癌旁组织Hugl-1和β-actin产物条带积分光密度值之比分别为0.91±0.26和3.27±0.43,癌旁组织表达水平为结直肠癌组织的3.59倍。统计分析显示Hugl-1mRNA在结直肠癌及癌旁组织中的表达水平差异有统计学意义（P＜0.05）。（2）Western-blot检测结果:结直肠癌组织Hugl-1蛋白表达下调,经图像分析系统分析表明,癌与癌旁组织Hugl-1和β-actin产物条带积分光密度值之比分别为1.18±0.19和3.76±0.42,Hugl-1蛋白在正常组织中的表达水平为结直肠癌组织的3.18倍,统计分析显示差异有统计学意义（P＜0.05）。（3）Hugl—1下调表达与肿瘤分期及淋巴结转移（P＜0.05）相关,与结直肠癌组织学类型、细胞分化程度以及患者的性别、年龄无关。结论:Hugl-1特异性下调表达于结直肠癌组织,可能是蛋白翻译水平和（或）代谢水平改变的结果。Hugl-1基因表达下降可能与结直肠癌的发生、发展过程有关。第二部分Hugl-1转染结直肠癌细胞株LS174及基因表达检测目的:建立并鉴定能稳定表达外源Hugl-1基因的结直肠癌细胞系LS174细胞以研究Hugl-1基因对结直肠癌细胞株LS174细胞生物学行为的影响。方法:将Hugl-1基因的真核表达质粒pcDNA3.1-Hugl-1和空载体pcDNA3.1质粒分别转化细菌、扩增提取纯化后,应用脂质体介导的方法分别转染体外培养的结直肠癌细胞株LS174细胞。G418筛选阳性克隆并扩增培养传代。用PCR法检测标签基因Neor的表达,RT-PCR和Western blot法分别观察分析转染前后目的基因Hugl-1在mRNA和蛋白质水平的表达变化。结果:重组体pcDNA3.1-Hugl-1转染细胞株和空载体pcDNA3.1转染细胞株均获得葡萄氨基糖苷类抗生素的抗性。因重组体pcDNA3.1-Hugl-1转染细胞株和空载体pcDNA3.1转染细胞株均携带有Neor标签,检测到了Neor的表达,证实转染成功。RT-PCR、Western-blot显示重组体pcDNA3.1-Hugl-1转染细胞株中目的基因Hugl-1在mRNA和蛋白质水平上表达均较空载体转染细胞株和未转染细胞株增强（P＜0.05）。结论:成功构建了分别能稳定表达外源pcDNA3.1-Hugl-1及空载体pcDNA3.1的结直肠癌细胞系。第三部分pcDNA3.1-Hugl-1重组载体转染细胞的生物学效应目的:研究外源基因Hugl-1转染对结直肠癌LS174细胞体外生长的抑制作用及其可能机理。方法:以我们成功构建的分别能稳定表达外源pcDNA3.1-Hugl-1、空载体pcDNA3.1的结直肠癌细胞株和未转染的LS174细胞为研究对象,通过MTT比色实验、软琼脂集落形成实验、划痕修复实验、细胞黏附实验和Transwell细胞侵袭实验等一系列细胞学功能实验,观察稳定转染细胞株Hugl-1的表达差异对肿瘤细胞增殖、粘附、运动和侵袭的影响。结果:对转染前后的细胞观察表明,Hugl-1表达并不影响细胞的增殖,重组体转染组细胞迁移运动和侵袭能力降低,细胞黏附能力增加。结论:Hugl-1基因重组体pcDNA3.1-Hugl-1稳定转染可以抑制结直肠癌LS174细胞迁移侵袭能力。
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