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铜绿假单胞菌GGDEF结构域蛋白质PA2771的结构和功能研究

2020-12-15阅读(554)

铜绿假单胞菌GGDEF结构域蛋白质PA2771的结构和功能研究

论文摘要

C-di-GMP是一种细菌中特有的新型第二信使分子,对于细菌的生物膜形成、细菌的抗药性及侵染能力、细胞分裂等有重要的调节作用。研究表明,c-di-GMP的合成和分解由含有GGDEF结构域的二鸟苷酸环化酶（DGC）和含有EAL或HD-GYP结构域的磷酸二酯酶（PDE）控制,而下游的信号传输由c-di-GMP结合蛋白质PilZ结构域蛋白和FleQ等进行。一般,GGDEF结构域和EAL结构域的蛋白质与一个或多个调节结构域的蛋白质偶联,并且通过调节结构域结合调节性配体,从而使活性受到外界因素的调节。目前,关于DGC结构域的蛋白质的活性调节机制已有蛋白质WspR和PleD通过结构的研究阐释的比较透彻。这两种蛋白质都含有Che-Y结构域和GGDEF结构。PleD通过磷酸化调节DGC活性,而WspR通过不依赖于磷酸化的c-di-GMP反馈抑制调节GGDEF结构域的DGC活性。与其他调节结构域偶联的GGDEF结构域的蛋白质结构及活性调节机制仍未得到解析。因此,关于与GGDEF结构域偶联的调节结构域对GGDEF结构域活性的调节机制的研究很有价值。本文选取了来自于铜绿假单胞菌的菌株PAO1的蛋白质PA2771作为研究对象,希望通过对其结构和生化性质的研究阐明其活性调节机制。PA2771含有一个属于GAF超家族的N端结构域和一个GGDEF结构域。全长蛋白质没有同源结构,而且,GAF部分与已知结构的GAF超家族的其他成员之间的同源性很低。GAF结构域是典型的可以结合调节性小分子并传导信号的调节结构域,我们希望通过结构生物学的方法研究阐释GAF结构域调控GGDEF结构域活性的机制。本文使用分子生物学的方法克隆表达和纯化了PA2771的native蛋白质和硒代蛋白质及PA2771的GGDEF结构域的蛋白质,并进行了晶体生长和优化,得到良好的单晶,在SSRF收集并处理了数据,用CCP4, COOT, Phenix及CNS等结构生物学软件解析了PA72771全长及其GGDEF结构域的结构。另外,本文使用了刚果红平板法、HPLC、MiniQ及显微拍照和紫外可见光谱法研究了PA2771的胞外和胞内酶活性及其对生物膜形成的影响。本文通过对PA2771的结构和生物化学研究揭示了PA2771的生化性质及GAF结构域调节GGDEF结构域活性的作用机制。研究表明,蛋白质PA2771在晶体及溶液中以二聚体的形式存在。在晶体中以GAF结构域的两个α-螺旋为主要接触面,形成活性中心互相远离的非活性二聚体。晶体中PA2771的抑制位点不结合c-di-GMP,原因推测为,其结合位点被GAF结构域的119-126位的loop区阻挡。并且RXXD的R251构象与结合c-di-GMP的同源结构不同,会与S121形成氢键,从而偏离可以与c-di-GMP形成氢键的位置。PA2771在溶液中为具有高酶活性的二聚体,活性不受c-di-GMP的产物抑制调控。在大肠杆菌BL21中过表达时,PA2771也具有高的酶活性,并且活力不随表达量的增加而降低而单独的GGDEF结构域,在晶体结构中以2个GGDEF结构域形成以c-di-GMP分子为中心的二聚体,并且蛋白质的活性受c-di-GMP产物抑制的调节。即在没有GAF结构域阻碍的情况下,GGDEF结构域可以结合c-di-GMP并且受产物抑制调控,从而支持了GAF结构域对于c-di-GMP结合阻碍的猜想。另外,我们还对GAF结构域结合的配体进行了分析。通过对三维结构比对搜索出的类似折叠类型的蛋白质所结合的小分子进行测试,我们发现,疏水性的小分子在GAF结构域的结合会降低蛋白质PA2771的活力,支持了我们对于配体结合对PA2771活性起负调控的猜测。依据这些实验结果,我们最终给出了PA2771的酶活性的负调节模型。即在GAF结构域不结合调节性配体的情况下,GAF结构域采取的构象使119-126的loop区阻碍c-di-GMP的结合,从而使PA2771具有高的胞外酶活性并不受c-di-GMP的产物抑制调控；当GAF结构域结合配体后促使GAF结构域构象发生变化,从而使PA2771的抑制位点空间被让出,开始受产物抑制的调控,酶活力降低。本文的研究给出了一种新的GGDEF结构域与其他调节结构域GAF偶联的结构。其中,N端属于GAF超家族的结构域,与其他已知的GAF结构域结构同源性很低,并且与多种结构未知的GAF超家族蛋白质有高度保守性的残基,属于一类新的GAF结构域的结构。而且C端的GGDEF结构域的二聚化方式与其他已知的GGDEF结构域的二聚化方式,及其和与c-di-GMP结合的方式都与已知结构不同,属于新的结合方式。最后,本文提出的GAF结构域通过结合配体促使GGDEF结构域抑制位点结合c-di-GMP,从而调节GGDEF结构域活力,这种负调节机制与其他已知结构的蛋白质的正调控不同。属于全新的调节方式。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 符号说明
  • 第一章 前言
  • 一、研究背景
  • 1. 细菌的信号转导途径与第二信使（文献综述）
  • 2. c-di-GMP信号转导途径
  • 2.1 c-di-GMP信号转导的研究历史
  • 2.2 c-di-GMP的研究现状
  • 2.2.1 c-di-GMP的合成和分解机制
  • 2.2.2 c-di-GMP胞内浓度的调控
  • 2.2.2.1 通过输入结构域来进行活性调节
  • 2.2.2.2 通过EAL与GGDEF结构域串联调节
  • 2.2.2.3 通过改变酶的稳定性调节c-di-GMP的代谢
  • 2.2.2.4 通过控制酶的定位来调节c-di-GMP的代谢
  • 2.3 c-di-GMP的下游信号转导机制
  • 3. GGDEF结构域的蛋白质的活性调节机制的研究现状
  • 4. 群体感应效应（quorum sensing）
  • 5. 铜绿假单胞菌
  • 二、研究内容、目的和意义
  • 第二章 研究材料与方法
  • 1. 菌株与质粒
  • 2. 实验试剂和工具酶
  • 3. 主要仪器
  • 4. 实验流程和方法
  • 4.1 基因的克隆
  • 4.2 蛋白的表达纯化
  • 4.2.1 蛋白表达
  • 4.2.2 蛋白纯化
  • 4.3 晶体生长及数据收集
  • 4.4 晶体结构解析
  • 4.4.1 数据处理
  • 4.4.2 相位确定
  • A. 同晶置换法
  • B. 反常散射法
  • 4.4.3 模型搭建
  • 4.4.4 结构精修（Coot,phenix）
  • 4.5 生化功能分析（酶活性测定-体内,体外）
  • 4.5.1 DGC活性的体外测定
  • 4.5.2 DGC活性的细胞内测定--刚果红平板方法
  • 4.5.3 生物膜检测-比色法
  • 4.5.4 生物膜检测-盖玻片气液边界显微照相
  • 第三章、实验结果
  • 1. PA2771的克隆和蛋白的表达纯化
  • 1.1 PA2771-pGL01的表达纯化
  • 1.2 PA2771-pET21b的克隆表达纯化
  • 1.3 PA2771硒代蛋白的表达纯化
  • 1.4 PA2771突变体的克隆表达和纯化
  • 1.4.1 PA2771-R251A-Pg101的表达纯化
  • 1.4.2 PA2771-E262A,E263A-pGL01的克隆表达纯化
  • 1.5 PA2771单个结构域的克隆表达和纯化
  • 1.6 铜绿假单胞菌WSPR的克隆表达和纯化
  • 1.7 大肠杆菌Pyrophosphatase的克隆表达和纯化
  • 2. 晶体的生长和优化
  • 2.1 PA2771 native晶体
  • 2.2 硒代PA2771的晶体
  • 2.3 PA2771-GTPγS复合物晶体
  • 2.4 PA2771与c-di-GMP的复合物晶体
  • 2.5 PA2771-N173-C end-pGL01结构域晶体
  • 2.6 PA2771-N173-Cend-pGL01结构域加GTP晶体
  • 3. 数据收集和结构解析
  • 3.1 PA2771 native数据和硒代数据的收集和结构解析
  • 3.2 GGDEF结构域的数据收集和结构解析
  • 4. PA2771的结构分析
  • 4.1 PA2771的整体结构
  • 4.2 PA2771的单体结构
  • 4.3 PA2771的二聚化分析
  • 4.3.1 PA2771的二聚化与c-di-GMP的结合
  • 4.3.2 PA2771在晶体中处于非活性二体状态
  • 4.5. 单独GGDEF结构域的结构分析
  • 5. PA2771酶活性调节模型
  • 5.1 PA2771全长及其GGDEF结构域的溶液中聚集状态的分析
  • 5.2 PA2771的DGC活性检测
  • 5.2.1 纯化的PA2771在体外具有DGC活性
  • 5.2.2 PA2771的酶活不受产物抑制调控
  • 5.2.3 PA2771在E.coli中具有DGC活性
  • 5.2.4 PA2771促进E.coli BL21的生物膜形成
  • 5.2.5 PA2771-GGDEF结构域的DGC胞内外活性测定
  • 5.3 GAF结构域的分析
  • 5.3.1 GAF结构域的结构分析
  • 5.3.2 PA2771结合的小分子的搜索
  • 5.3.2.1 Heme对PA2771结合及DGC活性的影响
  • 5.3.2.2 Biliverdin（胆绿素）对PA2771酶活力的影响
  • 5.3.2.3 FAD对PA2771的结合
  • 5.3.2.4 维生素E对PA2771的活性影响
  • 5.3.2.5 cGMP对PA2771的活性影响
  • 5.3.2.6 cAMP对PA2771活性的影响
  • 5.3.2.7 cmp对PA2771的结合
  • 5.4 PA2771酶活性调节模型总结
  • 全文总结与展望
  • 附录
  • 参考文献
  • 致谢

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