论文题目: 海参精氨酸激酶的折叠与结构研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 生物学
作者: 郭勤
导师: 王希成
关键词: 精氨酸激酶,化学修饰,定点突变,中间体,再折叠
文献来源: 清华大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本论文对海参肌肉中双亚基精氨酸激酶（AK）的催化机制进行了探讨,并以它为模型,研究了寡聚蛋白质的去折叠与再折叠机制。在海参 AK 的催化机制研究中,对 AK 的邻苯二甲醛（OPTA）修饰证明了在 AK 活性中心附近有一对半胱氨酸（Cys）和赖氨酸（Lys）。该 Cys-Lys 位于高度疏水的环境中,可能接近于 ATP 或者 ADP 与酶分子的结合部位。磷酸原激酶家族的序列同源性分析暗示这个活性必需的 Cys 很可能就是进化上保守的Cys-274。同时,本论文还运用定点突变的方法,研究了海参 AK 序列中保守的色氨酸在酶分子所起的作用。研究表明 Trp-218 和 Trp-208 都有助于维持 AK 的空间结构,且 Trp-218 是 AK 表现酶活必需的。另一方面,Trp-208 还可能在 AK正确折叠中起重要作用。在以海参 AK 为模型,探讨寡聚蛋白去折叠/再折叠机制时,本论文分别对AK 在热和变性剂条件下的可能去折叠/再折叠途径进行了研究,捕捉平衡态与动力学去折叠/折叠中间体。研究结果显示:AK 的热变性是一个不可逆的去折叠过程。AK 在热变性过程中,天然态 AK 活性中心最先被破坏,随之二聚体酶分子解聚成单体。单体极不稳定瞬间集合成可溶性的聚集,最后聚集体进一步集合成肉眼可见的沉淀。游离 Mg2+可以加速 AK 的热失活过程。对 AK 盐酸胍变性的平衡态研究表明:整个去折叠/再折叠过程为 N2←→I1→I2←→2U,至少经历了 I1与 I2两个二聚中间体状态。同时,复性过程中 I2到 I1的转变中存在一个能量壁垒,它阻止了变性 AK 的进一步正确折叠。渗压剂可以帮助部分变性 AK 克服这个壁垒效应。由于胍变性 AK 复性过程中存在的能量壁垒不利于 AK 复性途径的详尽的研究,本论文换用变性剂脲,对脲变性 AK 的复性分别进行了平衡态与动态过程的监测。平衡态实验结果表明:脲变性 AK 的复性至少经历了类似熔球态的二聚中间体（I2）和类似天然态的二聚中间体（I1）阶段。动态稀释复性的研究结果表明:AK 复性过程存在一个极快相中间体,其性质类似于平衡态中的 I1。
论文目录:
第1章 引言
1.1 精氨酸激酶(AK)
1.1.1 精氨酸激酶的研究概况
1.1.2 精氨酸激酶的进化
1.1.3 精氨酸激酶的催化动力学与热力学研究
1.1.4 精氨酸激酶的催化机制与活性中心研究
1.2 蛋白质化学修饰
1.2.1 蛋白质化学修饰概述
1.2.2 蛋白质化学修饰的作用
1.3 蛋白质的去折叠与折叠
1.3.1 蛋白质的去折叠研究
1.3.2 蛋白质折叠的研究意义
1.3.3 蛋白质折叠的理论模型与研究手段
1.3.4 蛋白质折叠的能量学
1.3.5 蛋白质的部分折叠态与过渡态
1.3.6 蛋白质的体内折叠
1.4 本论文的研究目的和主要内容
第2章 海参AK 活性中心附近有一对催化必需的半胱氨酸与赖氨酸
2.1 前言
2.2 实验材料与方法
2.2.1 实验材料
2.2.2 实验方法
2.3 实验结果
2.3.1 邻苯二甲醛（OPTA）修饰AK 的失活过程
2.3.2 OPTA 修饰AK 的光谱学特征
2.3.3 OPTA 修饰AK 的失活动力学
2.3.4 化学剂量学分析AK 活性必需的半胱氨酸-赖氨酸对数
2.3.5 OPTA 修饰AK 的底物保护
2.3.6 OPTA 修饰AK 的物理性质
2.4 讨论
第3章 海参AK 中色氨酸（Trp）在活性与构象中的作用
3.1 前言
3.2 实验材料与方法
3.2.1 实验材料
3.2.2 实验方法
3.3 实验结果
3.3.1 Trp 突变体的构建与表达
3.3.2 天然AK 与Trp 突变体的酶动力性质比较
3.3.3 天然AK 与Trp 突变体的荧光光谱及荧光焠灭比较
3.3.4 天然AK 与Trp 突变体的热稳定性比较
3.3.5 天然AK 与Trp 突变体的构象稳定性比较
3.4 讨论
第4章 海参AK 的热失活与热去折叠途径
4.1 前言
4.2 实验材料与方法
4.2.1 实验材料
4.2.2 实验方法
4.3 实验结果
4.3.1 海参AK 的热失活动力学
4.3.2 热变性过程中远紫外CD 变化
4.3.3 热变性过程中内源荧光变化
4.3.4 热变性过程中活力与构象变化的比较
4.3.5 DSC 研究AK 热变性
4.3.6 戊二醛交联与分子筛层析研究AK 热变性
4.3.7 AK 热变性过程中的底物保护
4.3.8 Mg~(2+)在AK 热变性中的作用
4.4 讨论
第5章 海参AK 在盐酸胍中的去折叠途径
5.1 前言
5.2 实验材料与方法
5.2.1 实验材料
5.2.2 实验方法
5.3 实验结果
5.3.1 AK 胍变性过程中酶活力与构象变化
5.3.2 酶浓度对AK 胍变性过程的影响
5.3.3 分子筛层析监测AK 的胍变性过程
5.3.4 戊二醛交联监测AK 的胍变性过程
5.3.5 胍变性AK 的再折叠过程
5.3.6 渗压剂对AK 再折叠过程的影响
5.3.7 AK 胍变性过程的热力学分析
5.4 讨论
第6章 脲变性海参AK 的再折叠途径——平衡态与动态研究
6.1 前言
6.2 实验材料与方法
6.2.1 实验材料
6.2.2 实验方法
6.3 实验结果
6.3.1 AK 复性过程中活力与光谱学性质的变化
6.3.2 AK 复性过程中分子聚合情况的变化
6.3.3 AK 复性过程中形成的可逆聚沉
6.3.4 AK 复性的动力学研究
6.3.5 AK 复性过程中平衡态中间体与动力学中间体之间的关系
6.4 讨论
第7章 结论
参考文献
致谢与声明
个人简历、在学期间的研究成果及发表的论文
发布时间: 2006-06-29
参考文献
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- [5].基于粗粒化模型的蛋白质聚合特性的研究[D]. 过馨露.南京大学2015
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