甲型H1N1流感重症患者外周血单个核细胞miRNA表达谱研究

论文摘要

甲型流感病毒引起的流行病严重危害人类健康,对全球经济带来巨大损失。深入研究复杂的宿主与病毒的相互作用可加快抗病毒药物的研发。MicroRNA（miRNA）是一类小（约22nt）的单链非编码RNA,广泛参与转录后基因表达调控。已有研究表明,miRNA参与了宿主与病原相互作用的调控。一方面,宿主miRNA可以参与天然免疫和适应性免疫反应,从而发挥抗病毒作用,甚至直接抑制病毒复制。另一方面,宿主miRNA也可能会被病毒利用。有关禽流感病毒感染鸡及重组1918病毒感染小鼠的miRNA表达谱研究已有报道。然而,目前还没有人感染流感病毒后相关miRNA的表达变化研究的报道。本研究共收集了11例甲型H1N1流感病毒筛查阳性的重症患者（无基础病如癌症等,甲流感染后引起的继发病除外）的外周血单个核细胞（PBMC）样本。其中5例重症患者和3例健康对照样本用于人miRNA基因芯片（Agilent）检测,全部11例重症患者和13例健康对照样本用qRT-PCR技术检测,以验证芯片技术的结果。通过芯片分析筛选到50个差异表达显著的miRNA。对miR-148a、miR-150、miR-31和miR-146b-5p采用TaqMan miRNA实时定量PCR验证,内参选用RNU44。Pearson相关性检验比较miRNA表达谱和qRT-PCR检测的各miRNA表达水平变化,R2为0.9726,证明芯片数据的可靠性。扩大样本量后,qRT-PCR结果分析表明miR-148a、miR-31及miR-150表达差异极显著,而miR-146b-5p没有统计学差异。随后对差异表达显著的miRNA的靶基因进行了生物信息学预测,并增添了已经实验验证的miRNA靶基因数据。此外,收集整理文献及公用数据库中宿主与流感蛋白质相互作用的数据。将这些数据整合,构建了miRNA介导的宿主与流感相互作用网络。对信号通路的分析发现,miRNA参与许多重要信号通路的调控,如MAPK信号通路、EGFR信号通路、TLR信号通路及趋化因子信号通路等。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 甲型H1N1 流感与miRNA 的研究进展
• 1.1 甲型H1N1 流感国内外研究概况
• 1.2 病毒感染相关miRNA 国内外研究概况
• 1.3 miRNA 功能研究方法概况
• 试验研究
• 第二章 甲型H1N1 流感重症患者PBMC miRNA 表达谱的鉴定研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 临床样本的收集及临床资料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.1.4 主要软件
• 2.2 方法
• 2.2.1 从全血中分离PBMC 细胞
• 2.2.2 从PBMC 细胞中抽提总RNA
• 2.2.3 Agilent miRNA 表达谱芯片分析
• 2.2.4 Microarray 数据处理
• 2.2.5 Microarray 数据提交
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 总RNA 质量检测结果
• 2.3.2 Agilent miRNA 表达谱芯片分析
• 2.3.3 差异表达miRNA 的非监督层次聚类分析
• 2.4 讨论
• 2.5 小结
• 第三章 芯片数据的miRNA qRT-PCR 验证分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 临床样本
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.1.4 主要软件
• 3.2 方法
• 3.2.1 PBMC 细胞总RNA 提取
• 3.2.2 RNA 质量鉴定
• 3.2.3 逆转录反应
• 3.2.4 qRT-PCR 检测
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 miRNA 表达谱芯片结果与qRT-PCR 验证结果比较
• 3.3.2 扩大样本量后qRT-PCR 检测四种miRNA 在H1N1 重症患者与健康组的差异
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 miRNA 介导的人与流感蛋白相互作用网络的构建与分析
• 4.1 材料
• 4.1.1 主要软件与数据库
• 4.2 方法
• 4.2.1 差异表达miRNA 靶基因预测
• 4.2.2 差异表达miRNA 已验证靶基因数据的获得
• 4.2.3 文献挖掘构建流感病毒与宿主蛋白相互作用数据库
• 4.2.4 构建miRNA 介导的人与流感病毒蛋白相互作用网络
• 4.2.5 Pathway enrichment analysis
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 miRNA-靶基因相互作用分析
• 4.3.2 流感病毒与人蛋白相互作用数据库的构建
• 4.3.3 miRNA 介导的人与流感病毒蛋白相互作用网络的构建
• 4.3.4 Pathway enrichment analysis 与重要信号通路子网络呈现
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介