抑癌基因PDCD4和PDCD5在卵巢癌中的作用及其机制研究

论文摘要

目的卵巢癌是妇科常见的恶性肿瘤,种类繁多,其中原发性卵巢上皮癌（最常见的是浆液性囊腺癌）占卵巢恶性肿瘤的85-90%。卵巢癌早期不易发现,就诊率低,病死率居女性生殖系统恶性肿瘤首位。临床上对于卵巢癌的治疗主要是采用手术及以铂类为主的联合化疗,尽管起初化疗效应约50-80%,但由于原发性与获得性耐药,患者的5年生存率仍然很低。因此,提高化疗敏感性,逆转化疗耐药（尤其是最常用的铂类化疗药物,如顺铂）是改善卵巢癌预后的关键。近些年来,基因治疗在肿瘤领域的成功应用为卵巢癌基因治疗奠定了基础,对恶性卵巢癌患者化疗药增敏基因和耐药基因的研究,成为卵巢癌治疗领域的热门课题。程序性细胞死亡-4（programmed cell death 4, PDCD4）是一种新的抑癌基因,可以通过抑制蛋白转录和翻译过程抑制肿瘤细胞的生长。我们和其他学者已经发现PDCD4在肺癌和神经胶质瘤等肿瘤中表达下调并且在肿瘤中发挥着非常重要的作用,但在卵巢癌中的作用尚未见报道。那么,PDCD4在卵巢癌中的表达状态如何?其对卵巢癌的发生发展到底有什么作用?能否影响卵巢癌的化疗敏感性并成为基因治疗的靶点之一?PDCD4的作用机制是什么,能否通过调控自噬的发生来发挥其在疾病中的作用?这些都是非常值得探索的问题。为了明确PDCD4在卵巢癌发生发展中的关系,阐明其发挥作用的机制,为PDCD4的临床应用提供理论依据和实验基础,本论文拟从以下三个方面进行研究：（一） PDCD4在人卵巢癌中的表达状态及其作用：通过多种方法检测正常卵巢、浆液性囊腺瘤和浆液性囊腺癌中PDCD4的表达发现,PDCD4在囊腺癌的表达出现明显的下调与缺失,并且与囊腺癌的病理级别密切相关。进一步研究发现,PDCD4在体外能够明显抑制卵巢癌细胞增殖和克隆形成能力,在裸鼠体内能降低卵巢癌细胞的成瘤能力,延长肿瘤发生的潜伏期。（二） PDCD4对卵巢癌化疗敏感性的影响及其机制研究：我们通过过表达和沉默表达PDCD4,从正反两方面证实PDCD4能显著增强卵巢癌细胞对铂类化疗药物的敏感性,在裸鼠体内PDCD4和顺铂联合治疗能有效地抑制卵巢癌的生长。进一步阐明其机制：PDCD4能够明显增强顺铂诱导的细胞凋亡,并且主要通过死亡受体通路介导的。（三） PDCD4在细胞发生自噬过程中的作用及其机制研究：PDCD4在卵巢癌细胞中过表达可以抑制自噬的发生,PDCD4-/-小鼠的巨噬细胞自噬水平明显高于C57小鼠。进一步的研究证明PDCD4是通过调控与自噬发生有关的p38MAPK通路来发挥作用。方法一、PDCD4在卵巢癌中的作用及其临床意义1.分别用RT-PCR. western blot和免疫组化方法检测人卵巢癌细胞系以及人正常卵巢、浆液性囊腺瘤和浆液性囊腺癌组织标本中PDCD4 mRNA和蛋白的表达情况。x2检验分析PDCD4在浆液性囊腺癌病例中的表达与其临床病理特点间的关系。2.利用脂质体转染PDCD4重组表达载体和G418筛选的方法建立PDCD4稳定表达的细胞系SKOV3-PDCD4和对照细胞系SKOV3-MOCK,用活细胞计数法检测PDCD4对细胞增殖能力的影响,平板集落形成实验检测PDCD4对细胞克隆形成能力的影响。3.将SKOV3,SKOV3-MOCK, SKOV3-PDCD4细胞分别注射到裸鼠腋窝皮下荷瘤,观察PDCD4表达对卵巢癌细胞SKOV3在裸鼠体内成瘤能力的影响。二、PDCD4对卵巢癌化疗敏感性的影响及其机制研究1.用MTT法检测四种卵巢癌细胞系,SKOV3、CAOV3、OVCAR3和3AO对顺铂的化疗敏感性,分析PDCD4表达水平与卵巢癌细胞对顺铂化疗敏感性的关系。2.在卵巢癌PDCD4相对低表达的卵巢癌细胞系SKOV3和CAOV3中,稳定或瞬时表达PDCD4,显微镜下观察细胞的状态,用MTT法检测PDCD4对卵巢癌细胞化疗敏感性的影响。3.设计合成两条PDCD4特异的siRNA,用siRNA沉默PDCD4高表达的卵巢癌细胞系OVCAR3中PDCD4的表达,干扰48小时后用RT-PCR和western blot检测PDCD4的表达,确定干扰效率。用MTT实验检测PDCD4沉默表达对卵巢癌化疗敏感性的影响。4.用卵巢癌细胞SKOV3注射到裸鼠腋窝皮下荷瘤后,随机分为6组,分别采用生理盐水,空载体,PDCD4载体,顺铂,空载体+顺铂,PDCD4+顺铂6种方法进行治疗,探讨PDCD4和顺铂联合治疗对肿瘤生长的影响。5.用PI染色,流式细胞仪检测PDCD4过表达对顺铂诱导的细胞周期变化的影响。进一步通过Hoechst染色从细胞形态学上观察PDCD4过表达对顺铂诱导的凋亡的影响,采用Tunnel染色对细胞的晚期凋亡率进行检测。6.应用western blot检测PDCD4过表达对顺铂诱导的凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9的活性变化及Bcl-2、Bax, c-FLIP蛋白表达变化。7.用caspase-8抑制剂抑致caspase-8的活性,检测PDCD4过表达对顺铂的化疗增敏作用的影响。8.利用流式细胞术检测PDCD4 j过表达对顺铂诱导的死亡受体DR5的表达状态的变化。三、PDCD4在细胞发生自噬过程中的作用及其机制研究1.用空载体或PDCD4重组表达载体转染卵巢癌细胞系SKOV3,转染48小时之后,采用饥饿的方法诱导细胞产生自噬,检测自噬标志性蛋白LC3的表达情况。2.分别获取C57和PDCD4基因敲除小鼠的腹腔巨噬细胞和骨髓来源的巨噬细胞,采用饥饿,LPS或雷帕霉素刺激诱导自噬的产生,western blot检测LC3表达情况。分别在C57和PDCD4基因敲除小鼠的腹腔巨噬细胞转染GFP-LC3,诱导自噬发生后,荧光显微镜观察GFP-LC3的表达分布情况。3.分别获取C57和PDCD4基因敲除小鼠的腹腔巨噬细胞,诱导自噬发生后,用ROS活性检测试剂盒,流式细胞术检测PDCD4对ROS活性的影响。Western blot检测PDCD4对自噬相关蛋白Beclin-1和自噬发生有关的p38MAPK通路中p38MAPK表达的影响。结果一、PDCD4在卵巢癌中的表达、临床意义及对肿瘤恶性行为的影响1. PDCD4在人卵巢癌细胞系和卵巢癌组织中的表达状况及临床意义为了研究PDCD4在卵巢癌中的作用,首先应用RT-PCR和western blot的方法检测了四种卵巢癌细胞系SKOV3、CAOV3、OVCAR3和3AO中PDCD4的表达情况,结果显示PDCD4在SKOV3和3AO中表达较低,CAOV3中度表达,OVCAR3表达相对较高。进而我们采用RT-PCR和免疫组化的方法检测了20例正常卵巢、26例浆液性囊腺瘤、43例浆液性囊腺癌组织中PDCD4的表达,发现与正常卵巢和浆液性囊腺瘤相比,PDCD4在浆液性囊腺癌中的表达明显下调甚至缺失。进一步分析发现,PDCD4的表达下调和缺失与浆液性囊腺癌患者高的病理级别密切相关。2.外源性PDCD4的表达能够明显抑制卵巢癌细胞的生长及克隆形成能力为了进一步研究PDCD4在卵巢癌中的作用,我们用脂质体介导将PDCD4重组表达载体和空载体转染到卵巢癌细胞系SKOV3中,并用G418进一步筛选,通过RT-PCR和western blot鉴定,得到稳定表达PDCD4的细胞系SKOV3-PDCD4和对照细胞系SKOV3-MOCK。通过活细胞计数的方法检测细胞增殖能力发现,SKOV3-PDCD4的增殖能力明显减弱（p<0.001）,克隆形成实验显示SKOV3-PDCD4的克隆形成数明显降低（p<0.05）,提示PDCD4在体外能明显抑制卵巢癌的恶性增殖能力。3.外源性PDCD4表达降低了卵巢癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力为了研究PDCD4在体内是否同样具有抑制卵巢癌恶性行为的能力,我们用SKOV3、SKOV3-MOCK、SKOV3-PDCD4细胞分别在裸鼠皮下进行荷瘤,观察肿瘤的生长。结果显示,SKOV3-PDCD4组的成瘤率明显降低,成瘤时间明显延长,而且形成的肿瘤大小和重量也明显低于其他两组（p<0.05）。这些结果显示,PDCD4过表达在体内同样可以抑制卵巢癌细胞的恶性行为。二、PDCD4对卵巢癌化疗敏感性的影响及其机制研究1. PDCD4表达水平与卵巢癌敏感性的关系上一部分研究提出PDCD4不仅在卵巢癌中表达降低,而且PDCD4在体内外都可以抑制卵巢癌的恶性增殖能力。然而,PDCD4能否增强卵巢癌的化疗敏感性,从而增强其疗效仍有待于进一步研究。我们通过MTT法检测上述四种卵巢癌细胞系SKOV3、CAOV3、OVCAR3及3AO对顺铂的化疗敏感性,分析PDCD4表达水平和其敏感程度的关系。结果显示,相对高表达PDCD4的CAOV3和OVCAR3细胞对顺铂更加敏感,而低表达细胞SKOV3和3AO则较不敏感,提示PDCD4表达水平可能与卵巢癌的化疗敏感性相关。2.外源性PDCD4表达可以增强卵巢癌细胞的化疗敏感性为了确定PDCD4对化疗敏感性的影响,我们在第一部分得到的稳定表达细胞系SKOV3-PDCD4和SKOV3-MOCK中分别加入不同浓度的顺铂,MTT检测细胞的生存率。结果显示,在12.5μg/ml浓度的顺铂作用下,SKOV3-PDCD4的细胞形态出现变圆或死亡,而SKOV3-MOCK没有明显的改变。MTT结果显示SKOV3-PDCD4的细胞生存率明显低于SKOV3-MOCK。我们通过瞬时转染的方法在CAOV3细胞中过表达PDCD4也发现了相似的结果,表明外源性的PDCD4表达可以增强卵巢癌细胞对顺铂的化疗敏感性。进一步检测了PDCD4过表达对其他化疗药物的影响,结果显示PDCD4同样也可以增强卵巢癌细胞对卡铂的化疗敏感性,但是对环磷酰胺,VP-16及紫杉醇的化疗敏感性没有明显的影响。3.沉默表达PDCD4减低了卵巢癌对顺铂的化疗敏感性为了进一步确定PDCD4对卵巢癌化疗敏感性的影响,我们设计合成了两条PDCD4特异性siRNA片段,将其转染PDCD4高表达的卵巢癌细胞系OVCAR3, RT-PCR和,western blot检测PDCD4表达发现,两条siRNA片段都能够有效的沉默PDCD4的表达（mRNA水平降低77%和76%,蛋白表达降低80%和88%）。进一步,我们采用这两条siRNA沉默OVCAR3中的PDCD4表达,发现其对顺铂的化疗敏感性明显降低（p<0.05）,从反方面验证了PDCD4能够增强卵巢癌对顺铂的化疗敏感性。4. PDCD4和顺铂体内联合治疗能明显抑制卵巢癌的生长为了验证PDCD4在体内能否增强卵巢癌对顺铂的化疗敏感性,我们用SKOV3细胞在裸鼠皮下荷瘤,随即分为6组进行治疗：生理盐水对照组,空载体组,PDCD4组,顺铂组,空载体+顺铂组,PDCD4+顺铂组。结果显示：PDCD4+顺铂组肿瘤的大小和重量（0.0375士0.0069 mm3,0.0300+0.0044 g）都明显的低于顺铂组（0.1386±0.0185 mm3,0.0860±0.0204 g）, PDCD4组（0.0779±0.0115 mm3,0.0533±0.0042 g）,和空载体+顺铂组（0.1621±0.0090 mm3,0.07667±0.0126 g）。通过免疫组化检测以上各组肿瘤中PDCD4的表达显示,有PDCD4载体治疗组的PDCD4表达明显增高,说明体内表达成功。体内实验结果显示PDCD4和顺铂联合治疗能明显抑制卵巢癌的生长,提示PDCD4在体内仍具有增强卵巢癌对顺铂的化疗敏感性的作用。5. PDCD4增强顺铂的化疗敏感性是通过诱导细胞凋亡,而不是改变细胞周期为了进一步检测PDCD4增强卵巢癌对顺铂化疗敏感性的机制,我们首先采用流式细胞术检测PDCD4对顺铂作用后细胞周期的影响,结果显示顺铂能明显诱导SKOV3细胞S期阻滞,这和其他有关顺铂的作用机制的研究报道是相一致的,但是PDCD4过表达对顺铂诱导的细胞周期改变没有明显的影响。进一步,我们通过Hoechst染色和Tunnel染色检测了细胞凋亡,结果显示在相同浓度顺铂作用下,与SKOV3-MOCK对照组（凋亡率为1.5%）相比,PDCD4过表达组SKOV3-PDCD4细胞的核固缩、碎裂明显增多,Tunnel染色流式细胞术检测显示PDCD4过表达组细胞凋亡率（30.1%）明显增高。这些结果说明PDCD4增强卵巢癌对顺铂化疗敏感性的机制主要是通过增强顺铂诱导的细胞凋亡,而对细胞周期的变化没有什么影响。6. PDCD4增强顺铂诱导的凋亡通路主要通过死亡受体通路介导细胞凋亡主要的信号通路分为线粒体通路和死亡受体通路。为了确定PDCD4增强顺铂诱导的凋亡通路,我们通过western blot检测了凋亡相关蛋白caspase-3,8,9以及Bcl-2,Bax的变化。结果显示,在相同浓度顺铂作用下,与SKOV3-MOCK对照组相比,PDCD4过表达组SKOV3-PDCD4细胞的caspase-3和caspase-8活性蛋白表达明显升高,而caspase-9和Bax具有轻微的升高,Bcl-2的表达没有明显变化,免疫组化检测肿瘤切片中的表达也得到了相似结果,提示死亡受体通路可能是PDCD4的主要作用通路。采用caspase-8抑制剂能够逆转PDCD4对顺铂的化疗增敏作用,进一步验证了这个结论。另外,在顺铂作用下,PDCD4过表达能明显上调死亡受体DR5的表达,内源性caspase-8的抑制蛋白c-FLIP-L的表达明显下调,可能是casapse-8活性蛋白升高的原因之一。根据这些结果,我们认为PDCD4主要通过死亡受体介导的凋亡通路促进了顺铂诱导的凋亡,从而增强了卵巢癌细胞对顺铂的化疗敏感性。三、PDCD4在细胞发生自噬过程中的作用及其机制研究尽管我们和其它学者的研究显示PDCD4可能通过诱导细胞凋亡或干扰细胞周期发挥作用,但其作用并不明显,不能完全解释PDCD4对肿瘤的有效抑制。自噬是近几年发现的细胞死亡的另一种形式,故进一步探讨了PDCD4对自噬的影响。1.外源性PDCD4表达抑制卵巢癌细胞发生自噬为了研究PDCD4对细胞自噬的作用,我们在SKOV3中过表达PDCD4之后,用饥饿诱导因素EBSS诱导自噬的发生,检测自噬的标记分子LC3蛋白的表达。结果发现,PDCD4过表达组LC3-Ⅱ明显降低,说明其自噬水平降低。进一步检测体内实验显示空载体和PDCD4表达载体治疗的肿瘤组织中LC3蛋白的表达也得到了相似的结果,说明PDCD4确实具有抑制卵巢癌细胞自噬发生的作用。2. PDCD4敲除后巨噬细胞自噬明显增强为了进一步确定PDCD4在自噬发生中的作用,我们获取了C57和PDCD4-/-小鼠的腹腔巨噬细胞和骨髓来源的巨噬细胞,分别用EBSS, LPS和雷帕霉素诱导自噬的发生,结果都显示PDCD4-/-小鼠的两种来源的巨噬细胞中LC3-Ⅱ表达明显升高。进一步在C57和PDCD4-/-两种小鼠的腹腔巨噬细胞中转染GFP-LC3质粒,LPS诱导自噬之后发现,PDCD4-/-小鼠的巨噬细胞中绿色荧光斑点明显多于C57小鼠,说明自噬小体形成增多,自噬水平升高。通过上述实验,我们得出结论：PDCD4敲除之后,自噬水平明显升高。3. PDCD4抑制LPS诱导的自噬可能是通过p38MAPK通路PDCD4本身可以抑制自噬的发生,PDCD4-/-小鼠的自噬也明显升高,其作用机制是什么呢?我们主要研究PDCD4对LPS诱导的自噬通路的影响,对LPS诱导自噬的几个通路进行了分析。我们通过流式细胞术检测ROS活性,结果发现PDCD4过表达对氧化应激通路没有明显的影响。进一步检测LPS诱导自噬作用下,自噬相关蛋白Beclin-1的表达,结果发现虽然LPS确实可以诱导Beclin-1的表达,但是PDCD4对这种诱导表达没有什么明显的影响,说明PDCD4不是通过ROS和Beclin-1介导的通路影响自噬。进一步探索发现LPS可以诱导磷酸化p38MAPK的表达,并且在PDCD4-/-小鼠的巨噬细胞中,这种诱导作用更加明显,磷酸化p38MAPK的表达明显高于C57小鼠,因此p38MAPK通路可能是PDCD4调控自噬发生的主要通路。结论1. PDCD4在人卵巢癌中表达明显降低甚至缺失,PDCD4的这种表达状态和卵巢癌高的病理级别密切相关。2. PDCD4过表达在体内外均可以抑制卵巢癌的恶性增殖能力。3. PDCD4在体内外都可以增强卵巢癌对顺铂的化疗敏感性。4. PDCD4增强顺铂化疗敏感性的机制主要是通过促进顺铂诱导的细胞凋亡,其通路主要是死亡受体介导的凋亡通路。5. PDCD4具有抑制自噬发生的作用,其作用可能是通过调控与自噬发生相关的p38MAPK通路来实现的。创新性和意义1.发现PDCD4在卵巢癌中表达降低甚至缺失,并且与肿瘤的病理级别密切相关。进一步通过体内外实验证明PDCD4过表达确实具有抑制肿瘤生长和恶性行为的能力,为PDCD4的临床治疗提供了理论和实验依据。2.国内外首次系统地研究了PDCD4与卵巢癌化疗敏感性的关系,并深入阐明了其机制。PDCD4在体内外均能够明显的增强卵巢癌对顺铂的化疗敏感性,其作用机制主要是通过促进顺铂诱导的细胞凋亡,其作用通路主要是死亡受体介导的凋亡通路。此研究不仅深入阐明了PDCD4的作用机制,而且为PDCD4应用与临床化疗药物联合应用提供了更有力的依据。3.国内外首次证明了PDCD4对细胞自噬的影响。细胞自噬是存在于所有细胞的一个广泛现象,生理水平对维持细胞的稳定有重要的作用,自噬失调将会参与很多疾病的发生。我们证明了PDCD4具有抑制自噬发生的作用,这不仅是对PDCD4的功能进行了补充,而且对深入研究很多疾病的发生机制具有重要的意义。研究的局限性1. PDCD4诱导死亡受体表达及降低c-FLIP-L的表达机制还有待于进一步研究。2. PDCD4抑制自噬发生的机制还有待于深入的研究。第二部分PDCD5在卵巢癌中的表达及其临床意义目的程序化死亡因子5基因（PDCD5）是北京大学人类疾病基因研究中心从白血病细胞株TF—1细胞中克隆的新基因。PDCD5蛋白在凋亡过程中不仅表达明显增加,而且在凋亡早期出现明显核转位现象,可能是一种细胞凋亡的早期信号。PDCD5单独不能对细胞产生明显的影响,只有在诱导凋亡的因素的存在下可明显促进凋亡,表明PDCD5是凋亡促进剂,而不是凋亡诱导剂。PDCD5作为促凋亡因子,已经证实在人类某些肿瘤如胃癌、胶质瘤等中表达降低,并且与病人的病理和预后相关,提示PDCD5可能和肿瘤的发生发展相关。但PDCD5在卵巢癌中表达和意义尚未见报道。本研究的目的主要是通过检测PDCD5在卵巢癌细胞系,浆液性囊腺癌、浆液性囊腺瘤以及正常卵巢中的表达水平,分析PDCD5表达与临床病理特征及预后之间的关系,为下一步研究其机制及与PDCD5的关系提供实验基础。方法一. PDCD5在人卵巢癌细胞和组织中的表达1.病例收集：收集山东大学齐鲁医院妇产科2001-2007年间41例浆液性囊腺癌,26例浆液性囊腺瘤,和20例正常对照（取自手术切除卵巢的非卵巢疾病患者）。所有患者手术前未接受任何放、化疗治疗。2.分别用RT-PCR、western blot及免疫组化的方法检测卵巢癌细胞系（SKOV3、CAOV3和OVCAR3）以及上述组织中PDCD5mRNA及蛋白质的表达。二、PDCD5在人卵巢癌组织中表达的临床意义1.利用x2检验及Fisher’s精确概率分析PDCD5表达和浆液性囊腺癌患者的年龄,发病部位,转移情况,病理分级和FIGO分期之间的关系。2.用Kaplan-Meier生存曲线分析PDCD5的表达与卵巢癌患者生存率之间的关系。结果一、PDCD5mRNA和蛋白在人卵巢癌细胞系中的表达为了探讨PDCD5在卵巢癌发生发展中的作用,我们首先用RT-PCR及western blot的方法检测了PDCD5在来源于浆液性囊腺癌的细胞系SKOV3、CAOV3和OVCAR3中的表达。结果显示,OVCAR3中表达较高的PDCD5mRNA和蛋白,SKOV3中表达较低,在CAOV3中虽然mRNA水平相对较高,但是蛋白水平仍然较低,表明在人浆液性囊腺癌细胞系中PDCD5的表达是降低的,提示PDCD5可能在卵巢癌中表达下调。二、PDCD5mRNA和蛋白在人浆液性囊腺癌组织中的表达进一步我们检测了正常卵巢,浆液性囊腺瘤（良性卵巢瘤）和浆液性囊腺癌组织中PDCD5的表达情况,结果显示在mRNA和蛋白水平,浆液性囊腺癌组织中的PDCD5表达下调甚至缺失,而在正常卵巢和浆液性囊腺瘤中均存在中等或高水平的PDCD5表达。进一步我们采用免疫组化的方法检测了20例正常卵巢,26例浆液性囊腺瘤和41例浆液性囊腺癌组织,结果显示所有的正常卵巢和浆液性囊腺瘤中PDCD5的表达都是阳性的,80%（16/20）的正常卵巢组织和76.9%（20/26）的浆液性囊腺瘤组织中PDCD5呈现中度或高度表达,然而,46.3%（19/41）的浆液性囊腺癌组织中呈现PDCD5低表达状态,甚至有22%（9/41）的浆液性囊腺癌组织中没有检测到PDCD5蛋白的表达。这些结果表明,PDCD5在卵巢癌组织中表达下调甚至缺失。三、PDCD5在浆液性囊腺癌的低表达状态和卵巢癌的FIGO分期相关为了进一步确定PDCD5在浆液性囊腺癌中低表达或缺失的临床意义,我们用χ2和Fisher’s精确检验法分析了PDCD5表达水平和患者的年龄,发病部位,转移情况,病理分级和FIGO分期之间的相关性。结果显示,PDCD5的表达水平和其他临床指标都没有明显的相关性,但是和患者的FIGO分期有显著的相关性,PDCD5高表达的比率在FIGO分期Ⅲ期和Ⅳ期病人中为19.2%（5/26）,明显低于其在FIGO分期Ⅰ期和Ⅱ期病人中的比率53.3%（8/15）。这些结果提示PDCD5在卵巢癌中的低表达状态和卵巢癌的进展相关。四、PDCD5在浆液性囊腺癌的低表达或缺失和病人的预后密切相关进一步,我们分析了PDCD5的表达和病人预后之间的关系。根据PDCD5的表达情况将病人分为两组：PDCD5高表达组（3-6分,n=16）,PDCD5低表达组（0-3分,n=14）。将两组的生存时间应用Kaplan-Meier生存曲线及生存率log-rank检验进行分析之后发现,PDCD5高表达患者的生存时间明显长于低表达组（p<0.05）,提示PDCD5的表达水平和患者的预后密切相关。结论1. PDCD5在人卵巢浆液性囊腺癌中表达显著降低甚至缺失。2. PDCD5在卵巢癌中的降低表达和卵巢癌病人的FIGO分期密切相关。3. PDCD5在卵巢癌中的表达水平和病人的预后有显著相关性。创新性和意义1.本研究发现PDCD5在卵巢浆液性囊腺癌中表达降低甚至缺失,并且和患者的FIGO分期密切相关,提出PDCD5可能在卵巢癌的发病中发挥重要作用。2.发现了PDCD5和卵巢癌病人的预后密切相关,为判断病人预后的依据提供了理论基础。并且初步提出PDCD5在卵巢癌发生发展的作用,为进一步研究PDCD5的作用和将来在临床治疗中的应用提供了依据和线索。局限性1. PDCD5对卵巢癌的生长及其恶性行为的影响有待于进一步研究。2. PDCD5在肿瘤中的作用机制至今还不清楚,有待于深入的研究。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一部分 PDCD4在卵巢癌中的作用及其机制
• 第一节 PDCD4在人卵巢癌中的表达状态及其作用
• 前言
• 一、PDCD4的发现和生物学特点
• 二、PDCD4与肿瘤发生的关系
• 三、研究目的
• 材料
• 方法
• 一、卵巢癌细胞系的培养
• 二、RT-PCR
• 三、Western blot
• 四、免疫组化
• 五、外源性PDCD4转染卵巢癌细胞系及稳定克隆的建立
• 六、PDCD4对卵巢癌细胞在裸鼠体内成瘤能力的影响
• 七、统计学分析
• 结果
• 一、PDCD4在人卵巢癌细胞系和原发卵巢癌组织中的表达
• 二、外源性PDCD4的表达能够明显抑制卵巢癌细胞的生长及克隆形成能力
• 三、外源性PDCD4表达降低了卵巢癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力
• 讨论
• 小结
• 第二节 PDCD4对卵巢癌化疗敏感性的影响及其机制研究
• 前言
• 一、卵巢癌的化疗药物和化疗敏感性
• 二、PDCD4的作用机制与化疗敏感性
• 三、研究目的
• 材料
• 方法
• 一、卵巢癌细胞系的培养及转染
• 二、RT-PCR检测PDCD4的表达
• 三、Western blot方法检测PDCD4及细胞凋亡相关分子的表达
• 四、免疫组织化学方法检测PDCD4及凋亡相关分子的表达
• 五、MTT法对卵巢癌细胞化疗敏感性进行测定
• 六、小干扰RNA的转染
• 七、细胞周期的检测
• 八、细胞凋亡的检测
• 九、体内荷瘤检测PDCD4在体内对顺铂化疗敏感性的影响
• 十、统计学分析方法
• 结果
• 一、PDCD4表达水平与卵巢癌化疗敏感性的关系
• 二、PDCD4在体外过表达可以增强卵巢癌的化疗敏感性
• 三、沉默表达PDCD4减低了卵巢癌对顺铂的化疗敏感性
• 四、PDCD4和顺铂在体内联合治疗能明显抑制卵巢癌的生长
• 五、PDCD4过表达能够明显增强顺铂诱导的细胞凋亡,但对细胞周期的改变没什么影响
• 六、PDCD4增强顺铂诱导的细胞凋亡主要通过死亡受体介导的凋亡通路
• 讨论
• 小结
• 第三节 PDCD4在细胞发生自噬过程中的作用及其机制研究
• 前言
• 一、自噬的发生过程
• 二、自噬的信号通路
• 三、自噬的检测方法
• 四、研究目的
• 材料
• 方法
• 一、PCR
• 二、Western blot
• 三、小鼠腹腔巨噬细胞的分离
• 四、小鼠骨髓细胞的分离和骨髓来源的巨噬细胞的诱导
• 五、自噬的诱导
• 六、荧光显微镜下观察GFP-LC3的表达
• 七、流式细胞术检测ROS活性
• 结果
• 一、PDCD4过表达有抑制卵巢癌细胞发生自噬的作用
• 二、PDCD4-/-小鼠的巨噬细胞在自噬诱导因素下自噬明显增强
• 三、PDCD4-/-小鼠的巨噬细胞在LPS诱导下ROS活性没有明显变化
• 四、PDCD4抑制LPS诱导的自噬可能是通过p38MAPK通路
• 讨论
• 小结
• 第二部分 PDCD5在卵巢癌中的表达状态及临床意义
• 前言
• 一、PDCD5的发现及生物学功能
• 二、PDCD5与肿瘤的关系
• 三、研究目的
• 材料
• 方法
• 结果
• 一、PDCD5mRNA和蛋白在人卵巢癌细胞系中的表达
• 二、PDCD5mRNA和蛋白在人浆液性囊腺癌组织中的表达
• 三、PDCD5在浆液性囊腺癌的低表达状态和卵巢癌的FIGO分期相关
• 四、PDCD5在浆液性囊腺癌的低表达或缺失和病人的预后密切相关
• 讨论
• 小结
• 附图表
• 参考文献
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表论文及编著目录
• 学位论文评阅及答辩情况表
• 附件1 英文文章1
• 附件2 英文文章2
• 附件3 英文文章3