富硒姬松茸提取物硒蛋白多糖在体内与体外的抗肿瘤效果研究

论文摘要

姬松茸,原产于巴西原始森林,1988年以来这种菌类植物已在日本和印度尼西亚广泛人工栽培。1995年中国科学院植物所梁净教授采用来自巴西原始森林的野生菌种在福建栽培成功,命名为国产姬松茸（也称为梁金菇）。姬松茸的主要成分如类固醇、多糖、糖蛋白复合物以及核酸等已被分离和纯化。其中发现姬松茸多糖具有抗肿瘤、提高机体免疫力及抗突变、杀菌作用等作用。2000年在我国第二大富硒区陕西省紫阳县秦巴山一带栽培成功,故命名为富硒姬松茸。已有的研究表明巴西姬松茸的药理学效应会受到不同生长条件的影响。而此富含硒的姬松茸抗肿瘤效应国内外尚未相关研究报道。本研究从栽培于我国的富硒姬松茸中分离纯化出硒蛋白多糖。应用Lowry酚试剂法、苯酚-硫酸法、2,3-二氨基萘荧光分光比色法测定硒蛋白多糖中蛋白质、多糖及硒含量,以半数致死量(LD50)评价其毒性水平。绝大多数应用血清药理学法的研究中,使用的药物处理血清主要来自于正常动物血清,部分来自于病理动物模型（如荷瘤）血清,尽管众多文献报道二者均具有良好的实验结果,然而两者之间的差异仍然未见相关研究报道。因此,本文通过体内、体外实验研究了硒蛋白多糖抗肿瘤效果并对比研究了硒蛋白多糖处理荷瘤与非荷瘤小鼠血清体外抗肿瘤效果的差异。具体内容如下:1.体内实验通过建立荷瘤小鼠模型,观察富硒姬松茸提取物-硒蛋白多糖的体内抑瘤作用及对荷瘤小鼠免疫功能的影响。2.体外实验应用血清药理学方法,用硒蛋白多糖处理荷瘤与非荷瘤小鼠后分离出血清,用MTT法观察硒蛋白多糖处理血清对K562细胞增殖的影响;形态学、DNA电泳技术观察凋亡发生;比色法检测凋亡相关蛋白Caspase-3的活性。研究结果显示:1.硒蛋白多糖中,蛋白质、多糖及硒含量分别为16.32%、81.20%、7.01mg/g。其半数致死量(LD50)＞3.0g/kg,属于低毒性物质。2.体内实验结果表明,硒蛋白多糖50.0、100.0mg/kg可以显著抑制BALb/c小鼠移植性肉瘤S180的生长,其抑瘤率分别为22.00%、和37.69%。并具有明显促进荷瘤小鼠NK细胞杀伤活性和淋巴细胞增殖的作用。提示硒蛋白多糖的抗肿瘤效应与其增强机体免疫力密切相关。3.体外实验结果表明,硒蛋白多糖处理血清可明显抑制体外K562细胞的增殖、诱导K562细胞产生典型的凋亡形态学变化,诸如核片段和凋亡小体的形成。DNA电泳中梯形带形成,这一经典的生化指标进一步证实了凋亡诱导作用。4.硒蛋白多糖处理血清可增强K562细胞内凋亡相关基因Caspase-3的活性,提示硒蛋白多糖处理的荷瘤小鼠血清促凋亡效应可能与上调Caspase-3基因表达有关。5.荷瘤小鼠与非荷瘤小鼠之间的硒蛋白多糖处理血清抗肿瘤作用有显著性差异（P＜0.01）,这一研究结果说明:要使实验结果能准确代表体内的真实环境,实验者在应用血清药理学实验方法进行实验时,应重视病理动物模型的建立。总之,本文通过体内、体外实验对栽培于我国富硒姬松茸的抗肿瘤效果及机制的研究,揭示了富硒姬松茸提取物-硒蛋白多糖可通过增强机体免疫力抑制体内肿瘤的生长,其处理的血清可通过上调Caspase-3的活性而诱导体外肿瘤细胞的凋亡。这些结果不仅对评价富硒姬松茸抗肿瘤的药用价值提供了有力的理论依据,也为中药血清学抗肿瘤的实验方法提供了可借鉴的经验。

论文目录

• 英文缩略词语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 前言
• 1 姬松茸研究概况
• 1.1 姬松茸对免疫系统的生物活性作用
• 1.2 姬松茸抗肿瘤作用
• 2 硒的抗肿瘤作用研究
• 3 多糖与抗肿瘤
• 4 血清药理学研究概况
• 5 细胞凋亡与肿瘤
• 5.1 Caspases的结构和生物学特性
• 5.2 Caspases的激活与诱发凋亡
• 6 研究目的
• 7 研究意义
• 第二部分 实验材料和方法
• 1 实验药材
• 2 实验动物
• 3 肿瘤细胞株
• 4 实验仪器和设备
• 5 实验试剂
• 6 实验方法
• 6.1 硒蛋白多糖的提取
• 6.2 蛋白质含量测定
• 6.3 多糖含量测定
• 6.4 硒含量测定
• 50)的测定'>6.5 半数致死量(LD₅₀)的测定
• 6.6 硒蛋白多糖对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响
• 6.7 硒蛋白多糖对荷瘤小鼠免疫功能的影响
• 6.8 硒蛋白多糖处理血清制备
• 6.9 细胞培养
• 6.10 四氮唑蓝比色法（MTT法）
• 6.11 吖啶橙染色
• 6.12 DNA片段电泳
• 6.13 Caspase-3活性检测
• 6.14 统计学处理
• 第三部分 实验结果
• 1 蛋白质含量测定
• 2 多糖含量测定
• 3 硒含量测定
• 50实验结果'>4 LD₅₀实验结果
• 5 硒蛋白多糖对小鼠S180肉瘤的抑制作用
• 6 硒蛋白多糖对S180荷瘤小鼠淋巴细胞增殖率的影响
• 7 硒蛋白多糖对S180荷瘤小鼠NK细胞活性的影响
• 8 硒蛋白多糖处理血清抑制K562细胞增殖
• 9 荧光显微镜观察结果
• 10 DNA琼脂糖凝胶电泳结果
• 11 Caspase-3活性检测
• 第四部分 讨论
• 小结
• 进一步研究设想
• 参考文献
• 攻读博士期间工作成绩
• 致谢