论文摘要
东亚钳蝎(Buthus martrnsii Karsch,BmK)是广泛分布于我国长江以北延伸到蒙古和朝鲜半岛的节肢动物。蝎毒中含有丰富的生理活性物质,其中主要活性成分是多肽(分子量3—9kDa),包括神经毒素和酶。这些活性多肽可选择性的特异结合并调控可兴奋细胞膜上的离子通道。迄今为止,已有近百种神经毒素相继被纯化。根据其分子量大小,它们可被分为长链和短链两大类。长链毒素一般由约60-70个氨基酸组成,含4对二硫键,主要作用于可兴奋细胞膜的Na+通道,由于对长链毒素的认识和研究比较早,其中部分蛋白质一级结构、高级结构、生物药理功能以及基因结构都有较清楚的阐述。短链毒素则由28—40个氨基酸残基组成,含3或4对二硫键,根据结构的同源性,这些小分子多肽又可分成若干类型,它们主要作用于K+或(和)Cl-通道。2000年,在同一期Toxicon中,中科院生化所和武汉大学两个课题组同时报道了从东亚钳蝎中分离得到一个由35个氨基酸组成、含四对二硫键的多肽,并命名为BmK CT(或Bm-12)。从序列同源性来分析,它与从以色列蝎(Leiurus quinquestriatus)中分离到的氯离子通道毒素有66%的同源性,由于无相关的实验确证其生理活性,暂且认为是类氯离子通道毒素(chlorotoxin-like peptide)。 人脑神经胶质瘤是严重危害人类健康的恶性肿瘤。手术切割虽然是目前主要的治疗手段,但其复发性极强,已成为临床上治疗神经胶质瘤的极大障碍,因此,寻找新型有效的、靶向性防癌、抗癌药物已迫在眉
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中文摘要英文摘要第一章 文献综述1 蝎神经毒素概述1.1 引言1.2 蝎神经毒素的性质1.2.1 一般理化性质1.2.2 东亚钳蝎毒素的电生理特性1.3 蝎毒素基因分子生物学研究1.3.1 蝎毒素cDNA结构及翻译后的加工1.3.2 蝎毒素基因组织结构及其mRNA的加工1.4 蝎神经毒素的结构与功能的研究1.4.1 长链蝎毒素的结构与功能研究1.4.2 短链蝎毒素的结构与功能研究1.5 蝎神经毒素的基因工程1.5.1 重组蝎毒素在原核细胞中的表达1.5.2 重组蝎毒素在真核细胞中的表达2 电压门控氯离子通道(CLC)的研究进展2.1 引言2.2 CLC通道的种类与分布2.3 CLC通道的特点2.3.1 拓扑结构2.3.2 CLC通道的双桶状结构2.4 CLC通道的药理学性质2.5 与CLC通道相关的疾病2.6 神经胶质瘤细胞中氯通道的研究3 论文的设计思路3.1 实验背景:蝎氯离子通道毒素及其在治疗人脑神经胶质瘤中的潜在价值3.2 实验的目的、技术方案流程及创新点4 参考文献第二章 利用搭桥PCR法人工优化合成东亚钳蝎类氯离子通道神经毒素(rBmK CTa)基因及其在大肠杆菌中的分泌表达、纯化与鉴定1 引言2 材料与方法2.1 实验材料2.2 主要试剂的配制2.3 实验方法2.3.1 东亚钳蝎类氯离子通道神经毒素rBmK CTa全基因合成策略2.3.2 表达质粒pExSecI-rBmK CTa和pExSecI-Bm-12的构建2.3.3 rBmK CTa基因的诱导表达及表达量的对比分析2.3.4 融合ZZ-rBmK CTa蛋白的纯化和切割2.3.5 rBmK CTa蛋白的Western blot鉴定3 实验结果3.1 搭桥PCR法合成东亚钳蝎类氯离子通道神经毒素rBmK CTa基因3.2 表达质粒pExSecI-rBmK CTa和pExSecI-Bm-12的构建3.3 重组菌的诱导表达分析3.4 分泌融合蛋白的表达与纯化3.4.1 IgG-Sepharose亲和层析3.4.2 Superdex75凝胶过滤层析3.5 羟胺切割重组融合蛋白ZZ—rBmK CTa及其产物分离纯化3.6 Western blot分析3.7 蛋白表达量的分析4 讨论4.1 rBmK CTa基因的合成4.2 东亚钳蝎类氯离子通道神经毒素蛋白的序列分析4.3 rBmK CTa的表达及纯化分析4.4 羟胺切割条件的分析5 参考文献第三章 东亚钳蝎毒素rBmK CTa的动物急性毒性和细胞毒性分析1 引言2 材料与方法2.1 实验材料2.2 实验方法2.2.1 动物急性毒性实验设计2.2.2 细胞毒性实验设计3 实验结果50的确定'>3.1 切割后rBmK CTa对小鼠的急性毒性实验和LD50的确定3.2 Wistar大鼠的乳鼠脑海马区神经胶质细胞的提取和培养3.3 预实验结果:纯化后的重组蛋白(ZZ—rBmK CTa)和切割后的rBmK CTa蛋白对正常鼠神经胶质细胞的毒性分析3.4 人神经胶质瘤细胞株SHG-44的培养3.5 rBmK CTa蛋白对正常鼠神经胶质细胞和人神经胶质细胞瘤SHG-44毒性的对比分析3.6 rBmK CTa蛋白对人白血病细胞株HL-60的毒性作用4 讨论4.1 rBmK CTa毒素对人神经胶质细胞瘤SHG-44的毒性与其它蝎毒素细胞毒性的对比分析4.2 rBmK CTa毒素在治疗人脑神经胶质瘤中的潜在价值5 参考文献第四章 膜片钳技术对东亚钳蝎类氯离子神经毒素(rBmK CTa)电生理学性质的确定1 引言1.1 膜片钳技术原理1.2 膜片钳的记录模式1.2.1 细胞吸附模式(On-cell mode)1.2.2 膜内面向外模式(Inside-out mode)1.2.3 全细胞模式(Whole-cell mode)1.2.4 膜外面向外模式(Outside-side mode)1.3 全细胞记录法基本实验操作1.4 全细胞记录法的应用1.4.1 离子通道宏观性质的分析1.4.2 离子通道微观性质分析1.4.3 离子通道的结构分析1.4.4 载体运输的性质和机能分析1.4.5 细胞内信息传递的分析1.4.6 细胞膜电容的测定1.4.7 对单细胞基因表达的分析1.5 全细胞膜片钳记录法的不足1.6 采用全细胞膜片钳技术确定东亚钳蝎rBmK CTa蛋白的性质2 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 仪器2.1.2 所需溶液的配制2.2 实验方法2.2.1 电极拉制及电极内液的充灌2.2.2 实验参数的设置2.2.3 细胞的准备和外理2.2.4 膜片钳实验2.2.5 数据处理3 实验结果3.1 rBmK CTa对人神经胶质瘤细胞株SHG—44氯离子通道的影响3.2 rBmK CTa对人神经胶质瘤细胞株SHG—44钾离子通道的影响3.3 rBmK CTa对人神经胶质瘤细胞株SHG—44钠离子通道的影响4 讨论4.1 人神经胶质瘤细胞膜上的氯离子通道4.2 rBmK CTa的电生理学性质的确定5 参考文献第五章 东亚钳蝎毒素rBmK CTa的多克隆抗体制备及利用Far Western法探测其在SHG-44上的受体1 引言1.1 抗体概述1.2 本章研究的目的和意义2 材料与方法2.1 材料2.1.1 主要仪器设备2.1.2 主要试剂2.1.3 试剂的配制2.2 实验方法2.2.1 抗原的制备2.2.2 抗血清的制备2.2.3 ELISA法检测抗体效价2.2.4 东亚钳蝎毒腺总蛋白提取2.2.5 东亚钳蝎毒总蛋白提取物的免疫印迹2.2.6 Far Western法探测rBmK CTa在SHG—44上的受体蛋白2.2.7 Pull Down实验获得受体蛋白2.2.8 受体蛋白的N-端测序3 实验结果3.1 rBmK CTa抗血清的效价检测3.2 东亚钳蝎的培养及毒腺总蛋白提取3.3 东亚钳蝎毒总蛋白提取物的免疫印迹3.4 Far Western法探测rBmK CTa在SHG—44上的受体蛋白3.5 Pull Down实验获得受体蛋白3.6 受体蛋白的N-端测序4 讨论4.1 rBmK CTa多克隆抗体的特异性4.2 Far Western方法获得已知蛋白互相作用的未知受体的研究4.3 蛋白质氨基酸测序的有关要求4.4 35 kDa蛋白前6个氨基酸的Blast分析5 参考文献第六章 东亚钳蝎毒素rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠主要器官的影响1 引言1.1 石蜡切片技术1.2 检测rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠各组织器官的影响的意义2 材料与方法2.1 实验材料2.1.1 实验动物2.1.2 实验仪器2.1.3 主要试剂的配制2.2 实验方法2.2.1 动物的处理2.2.2 石蜡切片的制作3 实验结果3.1 rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠肾组织的影响3.2 rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠大脑组织的影响3.3 rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠脾脏组织的影响3.4 rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠肝脏组织的影响3.5 rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠腿部骨骼肌肉组织的影响3.6 rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠肺组织的影响3.7 rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠心脏组织的影响4 讨论4.1 东亚钳蝎毒素rBmK CTa在药理浓度作用下对小鼠七种组织器官的影响4.2 以色列蝎(Leiurus Quinquestriatus)Chlorotoxin的药理学性质研究4.3 石蜡切片法与其他技术方法的结合4.3.1 与免疫学技术结合4.3.2 石蜡包埋组织流式细胞仪DNA含量分析4.3.3 石蜡切片标本是形态计量技术的基础5 参考文献第七章 东亚钳蝎毒素类氯离子通道神经毒素rBmK CTa蛋白的晶体生长条件的初步探索1 引言1.1 蛋白质结构测定的主要过程1.2 蛋白质结晶1.2.1 蛋白质结晶的原理1.2.2 结晶方法和技术1.3 相位问题1.3.1 确定相位的主要方法2 材料与方法2.1 实验材料2.2 实验方法2.2.1 晶体生长的方法2.2.2 晶体生长筛选条件的缓冲液配方3 实验结果3.1 rBmK CTa结晶条件的摸索4 结果讨论5 参考文献总结与展望附录Ⅰ 略语表附录Ⅱ一.个人简介二.攻读博士学位期间发表的论文三.主持和参与的科研项目四.奖励情况致谢承诺书
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标签:东亚钳蝎论文; 类氯离子通道神经毒索论文; 性质分析论文; 药理活性论文;