转基因调控OsGBSS Ⅱ和OsPull基因表达对稻米淀粉品质影响的研究

论文摘要

淀粉是稻米的最重要组成成分,占胚乳干重的70-90%,因此淀粉的组成与结构是决定稻米品质的重要因素。稻米胚乳中淀粉的合成受一系列酶的调控,其中淀粉粒结合淀粉合成酶（GBSS）和淀粉去分支酶（DBE）是参与淀粉合成中两类较为重要的酶,GBSS包括GBSSⅠ和GBSSⅡ,DBE包括普鲁蓝酶（PULL）和异淀粉酶（ISA）。目前对GBSSⅡ和普鲁蓝酶及其编码基因的具体功能,尤其是其在稻米品质形成中的作用还不清楚。本研究利用根癌农杆菌介导的转基因技术将OsGBSSⅡ基因的过量表达结构和RNA干扰结构以及普鲁蓝酶基因OsPull的RNA干扰结构导入品质不同的水稻受体品种中,进而研究其对稻米品质的影响。PCR和Southern杂交检测结果表明目的基因已经整合进了转基因水稻的基因组中。对转基因水稻进行了表达分析和稻米理化品质分析,主要研究结果如下:1、将水稻胚乳中特异表达的谷蛋白基因Gt1启动子控制的OsGBSSⅡ基因过量表达结构导入粳糯稻品种苏御糯和粳稻品种日本晴中。转基因水稻的RT-PCR和Northern杂交显示在大部分转基因水稻胚乳中可检测到OsGBSSⅡ基因的目的条带,不同转化子来源的转基因水稻OsGBSSⅡ基因的表达量不同,而在未转化对照胚乳中未检测到OsGBSSⅡ基因的目的条带。日本晴来源的转OsGBSSⅡ基因水稻中GBSS蛋白表达量提高,而苏御糯来源的转OsGBSSⅡ基因水稻和未转化对照都没有检测到GBSS蛋白的条带,可能是因为GBSS蛋白表达量太低。苏御糯来源的T2代转基因水稻直链淀粉含量与未转化对照相比稍有降低,胶稠度没有明显变化。日本晴来源的T2代转基因水稻直链淀粉含量与未转化对照相比稍有提高,胶稠度变硬,糊化温度没有明显变化。2、将OsGBSSⅡ基因RNA干扰结构分别导入粳糯稻品种苏御糯、粳稻品种日本晴和籼稻品种龙特甫中。Northern杂交和RT-PCR结果显示转基因水稻叶片中OsGBSSⅡ基因表达量与未转化对照相比明显降低,不同转化子间的降低幅度存在一定差异。T1代转基因水稻直链淀粉含量单粒测定结果显示苏御糯来源的转基因水稻与未转化对照相比直链淀粉含量提高,而日本晴和龙特甫来源的转基因水稻直链淀粉含量的变化没有明显的规律。T2代三种受体来源的转基因水稻直链淀粉含量的变化均没有明显的规律。T2代日本晴来源的转基因水稻与未转化对照相比胶稠度变硬,而苏御糯和龙特甫来源的转基因水稻没有明显变化。龙特甫来源的转基因水稻与未转化对照相比糊化温度提高,而日本晴来源的转基因水稻没有明显变化。3、将OsPull基因RNA干扰结构导入粳糯稻品种苏御糯、粳稻品种日本晴和籼稻品种龙特甫中。Northern杂交和RT-PCR结果表明转基因水稻OsPull基因表达量较未转化对照明显降低,不同转化子间的降低幅度也存在一定的差异。转基因水稻的普鲁兰酶活性与未转化对照相比显著或极显著下降。T1代转基因水稻直链淀粉含量单粒测定结果显示三种受体来源的转基因水稻直链淀粉含量的变化没有明显的规律。T2代三种受体来源的转基因水稻直链淀粉含量的变化也没有明显的规律,糊化温度没有明显变化。日本晴和苏御糯来源的转基因水稻胶稠度变硬,而龙特甫来源的转基因水稻无明显变化。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 1 前言
• 1.1 植物淀粉合成概述
• 1.2 植物淀粉合成中的关键酶
• 1.3 GBSSⅡ的研究进展
• 1.4 DBE 的分类
• 1.5 PULL 的研究进展
• 1.6 RNA 干扰机制及其应用
• 1.7 本研究的主要目的
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 供试水稻品种
• 2.1.2 菌株及双元载体
• 2.2 质粒DNA 的提取、纯化
• 2.3 培养基
• 2.4 水稻愈伤组织的诱导及培养
• 2.5 根癌农杆菌的培养及其介导的水稻共转化
• 2.5.1 根癌农杆菌的培养
• 2.5.2 水稻受体材料的侵染及其与根癌农杆菌的共培养
• 2.5.3 抗性愈伤组织的筛选及植株再生
• 2.6 转基因水稻植株中潮霉素抗性的检测
• 2.7 PCR 分析
• 2.7.1 水稻植株叶片总DNA 的提取
• 2.7.2 PCR 扩增
• 2.8 Southern 杂交分析
• 2.8.1 大量总DNA 的提取
• 2.8.2 地高辛标记的DNA 探针的制备
• 2.8.3 Southern 杂交分析
• 2.9 Northern 杂交分析
• 2.9.1 水稻胚乳总RNA 的提取
• 2.9.2 水稻叶片总RNA 的提取
• 2.9.3 Northern 杂交分析
• 2.10 RT-PCR 分析
• 2.11 水稻成熟种子中GBSS 蛋白的SDS-PAGE 分析
• 2.11.1 GBSS 蛋白的提取
• 2.11.2 SDS-PAGE
• 2.12 普鲁兰酶活性的测定
• 2.12.1 粗酶液的提取
• 2.12.2 活性测定
• 2.13 水稻成熟种子中直链淀粉含量（AC）的测定
• 2.13.1 样品前处理
• 2.13.2 大量测定
• 2.13.3 单粒测定
• 2.14 胶稠度和糊化温度的测定
• 2.15 淀粉粘滞性谱（RVA）分析
• 3 结果与分析
• 3.1 水稻种子中过量表达OsGBSSⅡ基因对稻米品质的影响
• 3.1.1 转基因水稻植株的获得
• 3.1.2 转基因水稻植株的分子鉴定
• 3.1.2.1 PCR 鉴定
• 3.1.2.2 Southern 杂交分析
• 3.1.3 转基因水稻中OsGBSSⅡ基因的表达分析
• 3.1.3.1 Northern 杂交分析
• 3.1.3.2 RT-PCR 分析
• 3.1.4 转基因水稻成熟种子中GBSS 蛋白表达量分析
• 3.1.5 转基因水稻成熟种子的品质表现
• 1 代转基因水稻成熟种子中的直链淀粉含量'>3.1.5.1 T₁代转基因水稻成熟种子中的直链淀粉含量
• 2 代转基因水稻成熟稻米的理化品质'>3.1.5.2 部分T₂代转基因水稻成熟稻米的理化品质
• 3.1.5.3 转基因水稻成熟种子淀粉的RVA 谱
• 3.2 RNA 干扰OsGBSSⅡ基因表达对稻米品质的影响
• 3.2.1 转基因水稻植株的获得
• 3.2.2 转基因水稻植株的分子鉴定
• 3.2.2.1 PCR 鉴定
• 3.2.2.2 Southern 杂交分析
• 3.2.3 转基因水稻中OsGBSSⅡ基因的表达分析
• 3.2.3.1 Northern 杂交分析
• 3.2.3.2 RT-PCR 分析
• 3.2.4 转基因水稻成熟种子的品质表现
• 1 代转基因水稻成熟种子中的直链淀粉含量'>3.2.4.1 T₁代转基因水稻成熟种子中的直链淀粉含量
• 2 代转基因水稻成熟稻米的理化品质'>3.2.4.2 部分T₂代转基因水稻成熟稻米的理化品质
• 3.2.4.3 转基因水稻成熟种子淀粉的RVA 谱
• 3.3 RNA 干扰OsPull 基因表达对稻米品质的影响
• 3.3.1 转基因水稻植株的获得
• 3.3.2 转基因水稻植株的分子鉴定
• 3.3.2.1 PCR 鉴定
• 3.3.2.2 Southern 杂交分析
• 3.3.3 转基因水稻中OsPull 基因的表达分析
• 3.3.3.1 Northern 杂交分析
• 3.3.3.2 RT-PCR 分析
• 3.3.4 普鲁兰酶活性的测定
• 3.3.5 转基因水稻成熟种子的品质表现
• 1 代转基因水稻成熟种子中的直链淀粉含量'>3.3.5.1 T₁代转基因水稻成熟种子中的直链淀粉含量
• 2 代转基因水稻成熟稻米的理化品质'>3.3.5.2 部分T₂代转基因水稻成熟稻米的理化品质
• 3.3.5.3 转基因水稻成熟种子淀粉的RVA 谱
• 4 小结与讨论
• 4.1 研究小结
• 4.2 有关水稻OsGBSSⅡ基因的功能
• 4.2.1 OsGBSSⅡ基因过量表达结构
• 4.2.2 OsGBSSⅡ基因RNA 干扰结构
• 4.3 有关水稻OsPull 基因的功能
• 4.4 研究展望
• 参考文献
• 附录
• 致谢