ATG16L1和IRGM基因多态性与克罗恩病相关性的初步研究

论文摘要

背景、目的克罗恩病（Crohn’s disease,CD）是炎症性肠病（IBD）的一个主要类型,是一种累及全层的节段性肠道非特异性炎症。CD在欧美国家常见,发病率约为1‰～10‰左右,亚洲的发病率远低于西方国家。近年来随着临床医生对CD认识的不断深入,以及临床内镜技术的不断发展,尤其双气囊小肠镜的应用,中国CD的检出率也有逐年上升的趋势。目前CD的病因及发病机制并不明确,临床表现也复杂多样,且容易误诊,复发率高,目前并无根治方法,临床常用药物治疗及手术效果往往欠佳,复发率高,无法彻底解决患者痛苦,严重危害人类的健康。人类的健康状态离不开体内稳定的内环境,而细胞稳态依赖于大分子物质生物合成和分解代谢之间的平衡。自噬（autophagy）是细胞用来达到这种动态平衡的重要机制之一,它普遍存在于大部分真核细胞中,从酵母到人类存在着共同的自噬分子调控机制。真核细胞的降解主要有两种途径,即蛋白酶降解和自噬,但只有自噬具有降解整个细胞器的效力。自噬是大分子物质和细胞器在溶酶体腔发生的降解途径,其作用主要是清除降解细胞内受损伤的细胞结构、衰老的细胞器、以及不再需要的生物大分子等,同时也为细胞内细胞器的构建提供原料,即细胞结构的再循环。因此,自噬是细胞成分更新、发育、分化及组织重塑的重要调控机制。自噬现象的存在对于防止如神经退行性病变、肿瘤、心肌病、病原微生物侵入感染等疾病以及对防止老化、延长寿命都有积极作用。因此对细胞自噬作用和自噬型细胞死亡的研究具有非常重要的价值。自噬基因的发现使我们从分子水平认识了自噬,自噬与病原微生物侵染之间的关系体现在吞噬细胞和淋巴细胞可杀死细胞外的病原菌,当病原菌以内吞形式进入细胞后自噬是细胞主要的防御形式。相关研究发现自噬的消长受多种因素影响:营养缺乏、胰高血糖素可以诱导自噬;胰岛素抑制自噬。他们的作用点在于影响氨基酸的浓度,当氨基酸浓度降低时,自噬启动以产生氨基酸保证器官成活;相反自噬被抑制。当自噬过程被干扰,导致细胞内受损伤的细胞结构、衰老的细胞器、不再需要的生物大分子、进入胞内的细菌等不能及时被清除,这些未能及时被清除的受损细胞、无用的蛋白质、细菌等会触发不适当的免疫反应,导致肠壁慢性炎症及CD特征性的消化道改变。此外,CD免疫调节异常学说认为,感染、病毒及药物等可破坏肠上皮屏障,使肠黏膜通透性增加、肠上皮细胞肿胀、吸收功能降低,上皮细胞营养缺乏、肠上皮细胞肿胀也有同胰岛素一样的抑制自噬的作用（如在肝组织,细胞容积的增大促进糖原、脂肪、蛋白质的合成;抑制自噬性蛋白降解）,其机理一是细胞内的氨基酸浓度增高;二是细胞内的离子浓度改变。此外,肠腔内摄入大量抗原,肠组织暴露于大量的抗原中,可诱发遗传易感宿主的黏膜反应,反复的刺激使肠道免疫系统过度反应和错误识别,激活巨噬细胞和淋巴细胞,释放一系列的细胞因子和炎症介质,导致机体的细胞免疫反应和体液免疫反应。免疫过程一旦被启动,免疫炎症反应就会逐级放大,最终导致组织损伤,出现CD的临床表现和病理改变。目前,国内外多项研究证明CD是一种复杂的多基因疾病,基因易感性和肠道细菌性抗原的相互影响和相互作用成为CD发生的重要因素,这一观点已逐渐被人们所认可,即携带遗传易感基因的宿主在环境因素参与下,免疫功能紊乱,最终导致疾病发生。随着基因研究的不断发展,最早明确的与欧美人CD易感性相关的NOD2/CARD15基因的单核苷酸多态性性（single nucleotidePolymorphisms,SNP）位点与中国人CD易感性并无明显相关;国外研究报道发现与机体自噬作用相关的ATG16L1基因及IRGM基因序列SNP位点与CD明显相关,发现并证实ATG16L1基因上有一个SNP位点（rs2241880）,IRGM基因上有2个SNP位点（rs13361189、rs4958847）与欧美白种人CD易感性有显著相关。本研究在国内外既往研究的基础上进一步对目前国外新研究发现的与欧美白种人CD易感性相关的白噬体基因ATG16L1与IRGM基因的多态性位点进行了研究,我们选取了国外研究报道中与欧美CD易感性相关的两个基因共3个SNP位点,初步研究与欧美人CD相关的易感性基因SNP位点与中国人CD易感性的关系,以及该SNP与CD临床特征的相关性,为进一步研究CD发病机制奠定基础,为防治该病提供理论依据。方法:1、收集2004-2007年南方医院消化科及普外科确诊临床资料完整、彼此无血源关系的广东及外省籍CD、UC患者（诊断标准参照2001年中华医学会消化病学分会制定标准心,所有患者均除外合并其它自身免疫性疾病）各40例;UC患者中病变部位位于直肠6例,左半结肠11例,右半结肠4例,全结肠19例,其中男27例,女13例,平均年龄36.38±12.00;CD患者中病变部位位于小肠15例,结肠13例,小肠合并结肠8例,直肠4例;CD按疾病的活动度分,缓解期6例,活动期34例,其中男26例,女14例,平均年龄32.7±9.46。对照组取门诊健康体检者50例,其中男32例,女18例,平均年龄34.58±9.37岁。所有研究对象均抽取外周血。提取白细胞基因组DNA,根据ATG16L1、IRGM基因三个SNP位点所在的外显子设计相应的引物,PCR扩增目的片段。2、成功扩增40例CD患者ATG16L1基因第九外显子后,将PCR产物纯化,然后通过美国SIB3730XL测序仪全自动测读序列,并与基因库数据对照,发现SNP位点改变后,对该样本序列进行反向测序,明确该SNP位点多态性改变,并用同样的一对引物扩增40例溃疡性结肠炎患者和50例健康体检者ATG16L1基因相应目的片断,纯化PCR产物,用同样的方法测序并与基因库数据对照。3、成功扩增IRGM基因的两个SNP位点所在的基因片断后,根据两个目的基因的SNP位点设计酶切引物及选择相应的限制性内切酶,PCR扩增目的基因片段,成功扩增后,纯化PCR产物,选择TasⅠ（TspEⅠ）和AluⅠ两个限制性内切酶酶切鉴定由国外研究证实的两个SNP位点rs13361189和rs4958847;并发现其在UC组及健康体检组的发生频率。结果:1、ATG16L1基因多态性位点rs2241880与中国部分CD的相关性通过DNA测序及对SNP位点发生杂合子改变和纯合子改变的样本进行反向测序验证,多态性位点rs2241880,其碱基由A变为G,密码子由ACT变为GCT,编码的氨基酸由苏氨酸突变为丙氨酸。病例组和正常对照组进行基因型频率及等位基因频率的组间比较显示:CD患者该SNP位点基因型频率及等位基因频率与正常人群比较基因型频率及等位基因频率差异无统计学意义,其结果分别为x2=0.187,P=0.911;x2=0.227,P=0.893;同样UC患者该SNP位点基因型频率及等位基因频率与正常人群比较基因型频率及等位基因频率的结果分别为:x2=0.394,P=0.821;x2=0.220,P=0.639;P＞0.05差异亦无统计学意义;CD与UC组基因型频率及等位基因频率相比结果分别为:x2=0.319,P=0.853;x2=0.102,P=0.750,提示CD与UC间差异无统计学意义。提示ATG16L1基因中该多态性位点rs2241880与中国人IBD疾病易感性无显著相关。2、IRGM基因多态性位点rs13361189、rs4958847与中国部分CD的相关性PCR-RFLP法验证IRGM基因SNP位点rs13361189的40例CD患者中,SNP位点发生改变的有36例,其中12例为纯合子,24例为杂合子;40例UC患者中24例发生多态性改变,其中10例为纯和子,14例为杂合子;50例健康者中46例发生多态性改变,其中18例为纯和子,28例为杂合子。各组间基因型频率比较差异无统计学意义（x2=1.669,P=0.796）;等位基因频率比较差异亦无统计学意义（x2=0.416,P=0.812）。通过PER-RFLP法及基因测序相结合的方法验证IRGM基因多态性位点rs4958847,发现在40例CD患者中24例（40.0%）出现等位基因多态性的改变,经基因测序证实均为杂合子改变,其中男性15例（62.5%）,女性9例（37.5%）;在健康组28例发生等位基因改变（56.0%）,其中男性18例（64.3%）,女性10例（35.7%）。经比较显示CD组与HC组间基因型频率的差异无统计学意义（x2=0.146,P=0.703）;等位基因频率的差异亦无统计学意义（x2=0.087,P=0.769）。结论:1、我们研究发现国外报道的与欧美白种人CD易感性相关的ATG16L1的多态性位点rs2241880在中国人CD、UC和正常健康对照组之间并无显著性差异,考虑ATG16L1基因中与欧美白种人CD易感性相关的SNP位点rs2241880,与我国CD患者易感性可能无关。2、位于IRGM基因与欧美白种人CD易感性相关的2个SNP位点（rs13361189、rs4958847）与中国部分CD患者易感性无显著相关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 一、关于ATGl6L1与IRGM基因
• 二、ATGl6L1基因多态性与CD易感的相关性
• 三、IRGM基因多态性与CD易感性的相关性
• 四、肠道菌群存CD管病中的作用
• 第一章 PCR直接测序法检测克罗恩病患者ATG16L1基因外显子
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 结果分析
• 第二章 PCR-RFLP验证IRGM的SNP位点与中国人CD相关性
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 酶切结果分析
• 全文结果总结
• 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 中英文缩略语词表
• 在读期间发表论文情况
• 致谢
• 研究生毕业论文统计学审稿证明