乙胺嘧啶协同替莫唑胺联合用药对小鼠垂体促性腺激素腺瘤细胞的影响

论文摘要

背景垂体瘤目前的治疗手段包括手术、放疗、药物等,但都有尚不完善的方面,尤其对于反复复发的一些大腺瘤来说。替莫唑胺（TMZ）是DNA烷化剂类化疗药,可透过血脑屏障,治疗胶质瘤和其他颅内肿瘤。目前TMZ在垂体瘤上的试验性用药尚处起步阶段,已发现对部分患者效果不佳,出现耐药的情况。有研究发现二氢叶酸还原酶抑制物乙胺嘧啶（PYR）协同替莫唑胺可使原对TMZ耐药的黑色素瘤细胞重新对常规用量TMZ敏感。若此协同作用对耐TMZ垂体腺瘤亦有效,则将会是垂体瘤TMZ治疗的一项进步。目的探索与替莫唑胺协同能克服肿瘤对其耐药性的药物,证明替莫唑胺在乙胺嘧啶协同下,能够增强其治疗垂体腺瘤时的细胞毒作用和抗耐药性,并探索其作用机制。方法普通细胞培养、耐药细胞筛选、MTS测细胞相对存活率、台盼蓝染色测细胞死亡率、PI染色流式细胞仪计数细胞周期分期、蛋白免疫印迹（Western Blot）测细胞特定蛋白相对含量等结果和结论1本实验在离体细胞水平证实了TMZ在PYR协同下,能够增强其治疗垂体腺瘤的细胞毒作用。结合PYR的药物特性,可以认为PYR是垂体腺瘤TMZ治疗的有潜力的联合用药伙伴。2本实验尝试筛选了对替莫唑胺相对耐药的小鼠促性腺激素腺瘤αT3-1细胞,在500umol/L的替莫唑胺环境中能稳定存活、缓慢增殖。其替莫唑胺拮抗蛋白MGMT含量有所升高。3对上述相对耐药的细胞株,TMZ+PYR联合用药的协同作用较普通细胞株更显著,提示PYR的存在能增强TMZ的抗耐药性。临床上TMZ治疗效果不满意的垂体腺瘤,可尝试加用PYR联合用药治疗,以避免增大TMZ用量引起的较强副作用。4本实验验证了TMZ单药的DNA破坏、促凋亡及G2期阻滞作用,符合其理论机制；验证了PYR单药的DNA破坏、促凋亡及S期阻滞作用,并证实上述细胞毒作用源于PYR的叶酸拮抗效应。5TMZ+PYR联合用药协同作用可以“双重打击”效应解释,可能有一部分细胞在两药效果单纯加和的计算中无法统计入死亡细胞比例中,但在联合用药存活率计算时则以死亡细胞统计,由此得到<1的CI指数。6TMZ+PYR联合用药的协同作用并非通过调节替莫唑胺拮抗蛋白MGMT的表达量实现,加用PYR不改变细胞的MGMT蛋白含量。

论文目录

• 英文缩略语对照
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 垂体腺瘤的治疗现状
• 2 替莫唑胺的现有作用
• 3 TMZ在垂体瘤上的试验性用药成果
• 4 耐药问题
• 5 乙胺嘧啶在替莫唑胺治疗耐药黑素细胞瘤中的作用
• 6 实验预期
• 材料
• 1 细胞株
• 2 主要试剂
• 2.1 细胞培养用品
• 2.2 药品
• 2.3 染液和指示剂
• 2.4 抗体
• 2.5 western blotting相关试剂
• 3 重要试剂的配制
• 3.1 药品
• 3.2 Western Blot相关试剂配制
• 4 统计学分析软件
• 5 仪器设备
• 实验方法
• 1 细胞传代、冻存、复苏
• 1.1 细胞传代
• 1.2 细胞冻存
• 1.3 细胞复苏
• 2 对替莫唑胺相对耐药的细胞株筛选
• 3 MTS法测定细胞存活率及药物对细胞增殖的半数抑制值
• 4 台盼蓝染色测定死亡细胞比例
• 5 流式细胞仪测定细胞周期分期及凋亡比例
• 6 蛋白免疫印迹（Western Blot）实验
• 6.1 细胞总蛋白提取及蛋白浓度测定
• 6.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 6.3 Western Blot
• 7 联合用药协同指数的计算
• 8 统计学处理
• 结果
• 1 乙胺嘧啶单药对αT3-1细胞增殖的影响
• 1.1 αT3细胞受梯度浓度PYR作用48小时后增殖受抑制情况
• 1.2 αT3细胞受各梯度浓度PYR作用72小时后增殖受抑制情况
• 1.3 细胞经不同浓度PYR处理72小时后的存活状况照片
• 2 替莫唑胺单药对αT3细胞增殖的影响
• 2.1 αT3细胞受各梯度浓度TMZ作用48小时后增殖受抑制情况
• 2.2 αT3细胞受各梯度浓度TMZ作用72小时后增殖受抑制情况
• 2.3 细胞经不同浓度TMZ处理72小时后的存活状况照片
• 3 替莫唑胺+乙胺嘧啶联合用药对αT3细胞增殖的影响
• 3.1 αT3细胞受各梯度浓度TMZ+0.5 umol/L PYR作用48小时后增殖受抑制情况
• 3.2 αT3细胞受各梯度浓度TMZ+0.5 umol/L PYR作用72小时后增殖受抑制情况
• 3.3 细胞经不同浓度TMZ+0.5umol/L PYR处理72小时后的存活状况照片
• 4 对替莫唑胺相对耐药的αT3细胞株加用TMZ、PYR及联合用药时的增殖受抑制情况
• 5 各用药组增加叶酸参与后αT3细胞的增殖情况
• 6 台盼蓝染色测定不同用药状况下的αT3细胞死亡比例
• 7 流式细胞仪测定不同用药状况下的aT3细胞细胞周期分期及凋亡比例
• 8 Western Blot示各用药组aT3细胞产生凋亡通路蛋白cleaved caspase 3情况
• 9 Western Blot示各用药组aT3细胞产生cleaved PARP情况
• 10 Western Blot示各用药组aT3细胞产生磷酸化组蛋白H2AX phosphorylation情况
• 11 Western Blot示各用药组aT3细胞MGMT蛋白含量
• 讨论
• 1 联合用药的诸多尝试
• 2 本实验获得的联合用药效果
• 3 耐药筛选株的联合用药
• 4 联合用药协同作用的机制研究
• 5 MGMT与用药的关系
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 综述
• 参考文献