论文摘要
目的:真核翻译起始因子4E （EIF4E）做为细胞生长和分化过程中重要的调控因子,与肿瘤的发生有着密切的关系。本研究通过转染人EIF4E基因的小干扰RNA（small interfering RNA）表达质粒,探讨其对乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学行为的影响。方法:设计合成靶向EIF4E基因的shRNA,与真核表达载体pGPU6/GFP/Neo克隆连接,构建pGPU6/GFP/Neo-EIF4E重组表达质粒,经酶切鉴定和测序分析后利用脂质体LipofectamineTM2000将鉴定正确的重组质粒转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞,采用RT-PCR、Western blotting、免疫细胞化学、免疫荧光法检测转染前后EIF4E、CyclinD1、VEGF-C、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表达情况;MTT法、平板克隆形成试验检测细胞增殖活性和克隆形成率;Hochest33258染色法检测细胞凋亡;流式细胞术检测细胞生长周期; Transwell试验、细胞划痕试验检测细胞侵袭及迁移能力的变化。结果:酶切及测序鉴定证实成功构建真核重组表达质粒pGPU6/GFP/Neo-EIF4E,并稳定转染人乳腺癌MDA-MB-231细胞。RT-PCR、Western blotting、免疫荧光法、免疫细胞化学法结果显示重组表达质粒组MDA-MB-231细胞EIF4E、Cyclin D1、VEGF-C、MMP-2、MMP-9 mRNA和蛋白表达均明显下降（P<0.05）。重组表达质粒组细胞生长缓慢,增殖能力降低,集落形成数明显减少,与空白对照组和空载体组比较差异有统计学意义（P<0.05）。Hchest33258染色观察到细胞核浓缩、深染、细胞膜改变等凋亡特征,凋亡指数明显高于对照组（P<0.05）。流式细胞术结果显示转染后G1期细胞百分比增高（71.3±0.467 vs 53.1±0.431）%,S期细胞明显减少（12.53±0.125vs 26.47±0.376）%（P<0.05）。侵袭实验结果,小室膜下的细胞数量空白组为（341.7±21.47）,表达质粒组为（79.43±11.21）,两者比较差异有统计学意义（P<0.05）;迁移实验结果,小室膜下细胞数量空白组为（639±47.34）,表达质粒组为（298.23±20.01）,两者具有显著差异（P<0.05）。细胞划痕实验结果显示重组表达质粒组细胞迁移能力明显下降（P<0.05）。结论:真核重组表达质粒pGPU6/GFP/Neo-EIF4E可显著下调EIF4E基因在乳腺癌MDA-MB-231细胞中的表达,在一定程度上抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移,促进细胞的凋亡,使较多的细胞停留在G1期,S期细胞减少,其作用机制可能与下调VEGF-C、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9的表达有关,提示该EIF4E siRNA序列可能成为治疗乳腺癌的一种有效手段。