Humanin通过抑制NMDA受体NR1亚基表达增加和NR2B亚基磷酸化在兴奋性神经毒中发挥保护作用

论文摘要

目的:过量谷氨酸对NMDA受体的过度激活导致神经元损伤直至死亡,称之为兴奋性神经毒。兴奋性神经毒在多种神经退行性疾病及各种神经损伤（如缺血性损伤）过程中发挥重要作用。因此预防和拮抗NMDA受体过度激活引发的兴奋性神经毒是预防和治疗各种神经损伤和神经疾病的重要靶点。NMDA受体是谷氨酸受体的一种亚型,属于配体和电压双控的离子通道,由已知三类NR1、NR2、NR3家族基因编码七种亚单位（NR1、NR2A-D、NR3A-B）组成四聚体复合物,与细胞内骨架蛋白交互作用定位于神经元突触后膜致密区（PSD）。研究表明,NMDA受体的NR1、NR2B亚单位的选择性表达、亚单位异聚体组成以及亚单位磷酸化状态等均可影响NMDA受体的功能从而在兴奋性神经毒过程发挥重要作用。Humanin（HN）最初由日本学者Hashimoto等在AD患者未受累及的枕叶获得的一种由75bp开放读码框架（ORF）编码的含24个氨基酸残基的多肽。研究证实,HN能特异性的抑制家族性阿尔茨海默病（FAD）基因突变及β—淀粉样蛋白（Aβ）沉积等诱发的神经元死亡,因而被命名为针对AD相关神经毒性作用的特异性神经保护肽。近期研究表明,HN亦可通过抑制Bcl-2家族细胞前凋亡蛋白Bid、Bim、Bax而发挥保护作用。本实验室前期研究也观察到,HN对于缺血、缺氧及在NMDA诱导的兴奋性神经毒模型中引起的神经元损伤发挥保护作用,表明HN可能具有广泛的神经保护作用。但HN拮抗NMDA受体发挥神经保护作用的机制不清。因此本实验设计旨在观察NMDA诱导的兴奋性神经毒模型中,HN是否通过影响神经元膜表面NMDA受体NR1亚单位蛋白表达的改变及NR2B亚单位的磷酸化水平而发挥其保护作用,以阐明HN发挥神经保护作用的机制或作用途径。方法:1、原代皮层神经元培养取新生1—3DIV（day in vitro,DIV）的Wistar大鼠大脑皮层组织,制成的细胞悬液种植于经过L—多聚赖氨酸包被的培养瓶或培养板上,置于37℃下5%CO2的培养箱孵育至第9DIV按照实验分组进行试验。2、实验分组在培养8DIV的HN组神经元培养液中加入HN,维持HN终浓度为1μmol/L。（1）对照（Control）组:Locke’s液(无Mg2+)（2）NMDA组:NMDA（100μmol/L）+甘氨酸（10μmol/L）（3）MK-801组:NMDA（100μmol/L）+甘氨酸（10μmol/L）+MK-801（10μmol/L）（4）HN组:NMDA（100μmol/L）+甘氨酸（10μmol/L）+HN（1μmol/L）3、检测方法（1）免疫细胞化学检测神经元膜表面NMDA受体NR1亚单位表达变化的形态学观察（2）流式细胞仪检测荧光定量检测神经元膜表面NMDA受体NR1亚单位蛋白表达（3）Western-blot神经元膜NMDA受体NR2B亚单位Tyr1472磷酸化水平的检测4、统计学处理测定结果数据均以（?）±s表示,运用SPSS11.5软件进行单因素方差分析,方差齐者组间比较用LSD检验,方差不齐组间比较用Games—Howell检验,检验水准α=0.05,P＜0.05表示有显著性差异。结果:1、HN拮抗NMDA诱导的兴奋性神经毒倒置显微镜观察培养的原代皮层神经元呈椭圆形、折光性好,活性强,有明显的神经元之间突触结构的联系;NMDA（100μmol/L）组的神经元表现出明显的毒性作用,包括神经元的胞体肿胀,突起较对照组明显消失,呈现悬浮生长;MK-801（NMDA 100μmol/L+MK-801 10μmol/L）组的镜下结果显示,上述毒性作用基本消失,神经元形态结构与对照组相比无显著差异,未发现明显结构改变;HN（NMDA100μmol/L+HN 1μmol/L）组的神经元形态结构与MK-801组结果相似,未发现明显的细胞毒性破坏的形态结构变化。结果表明,HN对于NMDA诱导的神经毒性作用（形态结构改变）具有抑制效应。2、HN抑制NMDA诱导神经元膜表面NMDA受体NR1亚单位蛋白表达的增加（1）免疫细胞化学检测与对照组相比,NMDA组中绿色荧光标识的NMDA受体NR1亚单位蛋白在神经元胞体两极朝向突起的起始部位及核膜表面的表达显著增加。与NMDA组比较,HN组和MK-801组绿色荧光标识的NMDA受体NR1亚单位蛋白表达显著减少。结果表明,NMDA可诱导神经元膜表面NMDA受体NR1亚单位蛋白表达的增加,而HN可减弱由NMDA诱导的神经元膜表面NMDA受体NR1亚单位蛋白表达的增加。（2）流式细胞仪荧光定量检测流式细胞仪的荧光定量检测发现,对照组NR1的平均荧光强度值为26.688±1.507,NMDA组NR1的平均荧光强度值为48.708±3.494,表明NMDA受体NR1亚单位蛋白在NMDA诱导下表达量明显增加,两者比较具有显著性差异（p＜0.05）;MK-801组NR1的平均荧光强度值为27.686±2.140,HN组NR1的平均荧光强度值为29.74±3.288,两者分别与NMDA组比较都具有统计学意义（p＜0.05）。上述结果表明,在NMDA和HN共同孵育2h的神经元中,HN能抑制由NMDA诱导的NMDA受体NR1亚单位蛋白表达的增加,与免疫细胞化学检测的定性检测结果一致。3、HN抑制NMDA诱导神经元膜表面NMDA受体NR2B Tyr1472磷酸化水平的增强Western-blot结果显示,在实验各组中,总NR2B亚单位蛋白表达水平没有改变,而NMDA组的NR2B Tyr1472磷酸化水平较对照组明显升高（p＜0.05）,HN组的NR2B Tyr1472磷酸化水平较NMDA组的明显降低（p＜0.05）。结果表明,NMDA可诱导NMDA受体NR2B Tyr1472磷酸化水平增强,而HN可降低NMDA诱导的NMDA受体NR2B Tyr1472磷酸化水平的增强。结论:1、NMDA诱导体外培养的皮层神经元NMDA受体NR1亚单位表达增加,提示NMDA受体数量增加。2、NMDA诱导体外培养的皮层神经元NMDA受体NR2B亚单位磷酸化水平增强,由此可能增强NMDA受体通道的功能,包括在兴奋性神经毒过程的作用增强。3、HN可抑制NMDA诱导神经元膜表面NR1亚单位表达的增加以及使NR2B亚单位磷酸化水平下调,这可能是HN抑制兴奋性神经毒发挥神经保护作用的重要基础。

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