论文摘要
业已证明,日本血吸虫31/32kDa天然分子抗原,不仅是一种优势诊断抗原,可用于免疫诊断,同时也具有较好的抗雌虫生殖免疫的效果。为了对Sj31/32kDa分子抗原进一步深入分析,我们采用蛋白质组学研究技术,我们建立了日本血吸虫成虫可溶性抗原二维电泳图谱。对Sj31/32kDa附近的蛋白质斑点进行肽指纹图谱、质谱分析,在Sj31/32kDa附近获得了3个同源性较高的蛋白质斑点（11,20,23号）,分别与日本血吸虫-3-磷酸甘油脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate）、曼氏血吸虫组织蛋白酶B内肽酶（Cathepsin B endopeptidase）、曼氏血吸虫肌动蛋白-2（Actine-2）相匹配。有报道表明,血吸虫组织蛋白酶B内肽酶参与对宿主血红蛋白的降解,与血吸虫的生长发育有关,具有潜在的血吸虫病疫苗价值。目前国内外尚未见对该基因研究的相关报道。研究目的确定日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶（SjCB）是否能作为抗血吸虫病天然分子基因疫苗的靶标,及其在血吸虫体内是否有期特异性,获得针对日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶的特异性单链抗体,为抗血吸虫病天然分子候选疫苗编码基因的筛选及重组优势抗原诊断血吸虫病的研究奠定基础。研究方法1.收集尾蚴感染后32d的日本血吸虫成虫,制备成虫可溶性蛋白,经一维电泳、固相pH梯度双向凝胶电泳分离,选取31/2kDa附近的蛋白点进行质谱分析鉴定,凝胶图像分析软件对结果进行处理。2.以血吸虫cDNA文库为模板,设计引物扩增得到目的基因,亚克隆至pcDNA3.0载体;以成虫和尾蚴真核重组质粒分别免疫小鼠,观察其免疫保护性效果。3.将目的基因亚克隆至pQE30载体,将重组质粒转化至感受态大肠杆菌M15,IPTG诱导表达融合蛋白,并进行SDS-PAGE和Western blot分析。His-tag标签柱亲和纯化融合蛋白。4.用日本血吸虫成虫可溶性抗原（AWA）免疫BALB/C小鼠,提取小鼠脾脏RNA,RT-PCR法扩增得到全套VH和VL基因,经重叠PCR法扩增得到scFv片段,将scFv片段克隆至pCANTAB5E载体,电转化至感受态大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07拯救,即获得日本血吸虫成虫可溶性抗原表面呈现单链抗体库。以纯化的目的融合蛋白为靶抗原,分别筛选成虫可溶性抗原单链抗体库和UV-致弱尾蚴单链抗体库,以获得相应的特异性单链抗体。研究结果1.二维电泳结果显示Sj31/32kDa附近有13个蛋白点,经MALDI-TOF-MS鉴定及分析,发现3个蛋白分子分别与曼氏血吸虫Actine-2,日本血吸虫3磷酸甘油脱氢酶,曼氏血吸虫组织蛋白酶B内肽酶有高度的同源性。2.真核重组质粒成虫pcDNA3.0/SjCB和尾蚴pcDNA3.0/SjCB得以成功构建,限制性双酶切、PCR鉴定及核苷酸测序结果显示二者基因序列具有99%的同源性;动物实验结果表明重组质粒成虫pcDNA3.0/SjCB免疫组的减虫率为38.99%,每雌减卵率为34.45%,每克肠道减卵率为40.18%,每克肝脏减卵率为43.24%;重组质粒尾蚴pcDNA3.0/SjCB免疫组的减虫率为38.36%,每雌减卵率为41.00%,每克肠道减卵率为39.30%,每克肝脏减卵率为44.87%,与对照组比较有显著差异（P＜0.05）。而重组质粒成虫pcDNA3.0/SjCB组和尾蚴pcDNA3.0/SjCB组减虫率和减卵率无显著差异（P＞0.05）。3.原核重组质粒成虫pQE30/SjCB和尾蚴pQE30/SjCB得以成功构建,限制性双酶切、PCR鉴定及核苷酸测序结果显示融合蛋白表达正确,并得以有效纯化。分别被成虫可溶性粗抗原免疫血清和UV-致弱尾蚴免疫血清识别,而不被正常鼠血清识别。4.构建了日本血吸虫成虫可溶性抗原单链抗体库,库容为4.3×108,重组率为90%,且BstNI酶切图谱呈多样性,初步筛选出了针对成虫pQE30/SjCB和尾蚴pQE30/SjCB表达的融合蛋白的特异性重组噬菌体。结论1.成功构建了成虫pcDNA3.0/SjCB和尾蚴pcDNA3.0/SjCB真核重组质粒以及成虫pQE30/SjCB和尾蚴pQE30/SjCB原核重组质粒,成虫及尾蚴SjCB基因序列无差异;原核重组蛋白具有很好的免疫反应性。2.动物实验结果表明,成虫pcDNA3.0/SjCB和尾蚴pcDNA3.0/SjCB真核重组质粒免疫小鼠后,能诱导产生部分抗日本血吸虫免疫的保护力,证明了日本血吸虫组织蛋白酶B内肽酶是抗日本血吸虫病有效的候选分子之一。3.成功构建了日本血吸虫成虫可溶性抗原单链抗体库,为抗日本血吸虫病天然分子候选疫苗编码基因的筛选及重组优势抗原用于血吸虫病诊断的研究奠定了基础。