抗BLyS单链抗体的构建、纯化和初步活性鉴定

论文摘要

B淋巴细胞刺激因子（B lymphocyte stilulator，BLyS）是一种主要由巨噬细胞和树突状细胞产生的肿瘤坏死因子，广泛参与了机体免疫，对外周B淋巴细胞的生存、成熟和分化，生发中心的形成，浆细胞抗体的分泌等生命过程有着至关重要的作用。BLyS的不正常表达与人类多种疾病相关，如免疫缺陷病，自身免疫性疾病和B细胞淋巴瘤等。研究表明自身免疫性疾病和血液系统恶性肿瘤患者体内的BLyS水平明显升高，而且BLyS信号的阻断对此类疾病的发展有显著的治疗作用。单链抗体（ScFv）既具备抗原结合得特异性，又具有分子量小、穿透力强免疫原性低的特点，在免疫学和生物医学领域有着广阔的应用前景。因此抗BLyS单链抗体具有治疗自身免疫性疾病和B淋巴瘤的潜在作用。本课题研究方法：运用计算机模拟技术设计抗BLyS单链抗体的基因序列（VHL和MHL），用重叠PCR等方法构建重组质粒，借助原核表达系统表达并纯化目的蛋白，通过ELISA技术初步检测抗体的活性。主要研究成果：（一）扩增了两种抗体的重链和轻链可变区，并用重叠PCR方法构建了两种单链抗体基因片段，并且分别添加了Myc标签和Fc标签，VHL-Myc大小为780bp，MHL-Fc大小为1500bp。（二）构建了VHL-Myc-pET28a和MHL-Fc-pET28a表达载体，对蛋白表达的诱导条件进行了优化，获得了较高水平的表达。蛋白大量表达后利用Ni亲和柱从包涵体中纯化出两种目的蛋白。（三）体外活性检测结果显示VHL-Myc能够与特异性BLyS结合，并且这种结合是剂量依赖的。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 BLyS的结构及表达
• 1.2 BLyS的信号通路
• 1.3 BLyS的生物学功能
• 1.3.1 BLyS对B细胞的作用
• 1.3.2 BLyS对T细胞的作用
• 1.4 BLyS相关疾病
• 1.4.1 免疫缺陷病
• 1.4.2 自身免疫性疾病
• 1.4.2.1 系统性红斑狼疮
• 1.4.2.2 类风湿性关节炎
• 1.4.2.3 干燥综合症
• 1.4.3 血液系统恶性肿瘤
• 1.5 以BLyS为靶点的治疗药物研究进展
• 1.5.1 BLyS拮抗剂
• 1.5.2 抗BLyS单克隆抗体
• 1.5.3 其它BLyS相关药物
• 1.6 总结与展望
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌株
• 2.2.2 载体
• 2.2.3 工具酶、抗体及试剂盒
• 2.2.4 常用试剂
• 2.2.5 实验仪器
• 2.2.6 溶液的配制
• 2.3 方法
• 2.3.1 感受态细胞的制备
• 2.3.2 VHL-Myc单链抗体的构建、纯化和活性检测
• 2.3.2.1 VHL-Myc抗体的构建
• 2.3.2.2 VHL-Myc抗体的表达及纯化
• 2.3.2.3 VHL-Myc抗体的体外活性检测
• 2.3.3 MHL-Fc融合蛋白的构建、纯化和活性检测
• 2.3.3.1 MHL-Fc融合蛋白的构建
• 2.3.3.2 MHL-Fc融合蛋白的表达及纯化
• 2.3.3.3 MHL-Fc融合蛋白的抗原活性检测
• 第三章 实验结果与讨论
• 3.1 VHL-Myc单链抗体的构建、纯化和活性检测
• 3.1.1 VHL-Myc单链抗体的构建
• 3.1.2 VHL-Myc单链抗体的表达及纯化
• 3.1.2.1 表达条件的优化
• 3.1.2.2 VHL-Myc蛋白的纯化
• 3.1.3 VHL-Myc单链抗体的体外活性检测
• 3.1.3.1 VHL-Myc抗原活性的检测
• 3.1.3.2 VHL-Myc与BLyS的结合活性检测
• 3.2 MHL-Fc融合蛋白的构建、纯化和活性检测
• 3.2.1 MHL-Fc融合蛋白的构建
• 3.2.2 MHL-Fc融合蛋白的表达及纯化
• 3.2.3 MHL-Fc融合蛋白抗原活性的检测
• 第四章 实验总结
• 参考文献
• 发表论文和科研情况说明
• 附录
• 致谢