硫化叶菌内切β-1，4-葡聚糖酶基因及甘露聚糖酶基因的克隆、表达与功能分析

论文摘要

β-甘露聚糖酶和内切p-1,4-葡聚糖酶是重要的工业用酶,广泛的应用于饲料业、造纸业、啤酒工业等领域。为了满足生产的要求,对工业用酶耐热耐酸高活性方面的研究日益增多。木研究的主要目的是,从极端微生物中挖掘一些有潜在工业价值的嗜热酶,尝试利用冰岛硫化叶菌蛋白表达系统,探索这些嗜热酶在工业化应用中的可行性。本研究获得如下结果：（1）利用PCR技术从冰岛硫化叶菌REY15A （S. islandicus Rey15A）中分别扩增得到带有和不带有信号肽编码序列的内切p-1,4-内切葡聚糖酶基因（Sis eng）,并将其克隆至硫化叶菌表达载体pZC2中,构建重组表达载体pZC2-eng-YS和pZC2-eng-WS,并转化至S.islandicus E233S （△pyrEF△lacS）。重组菌株经D-阿拉伯糖诱导后,细胞破碎上清经Ni-NTA柱纯化,得到重组蛋白。SDS-PAGE结果表明不带有信号肽的葡聚糖酶（ENG-W）分子量为41 ku,带有信号肽的分子量（ENG-SP）为43 ku。酶学性质分析表明前者没有酶活性；后者酶活力为103.4 U/L,最适反应温度为90℃,最适pH为4.0,耐热性实验结果表明在90℃保温60 min后酶活力稳定在最高酶活力的40%以上；金属离子实验结果表明,终浓度为1mmol/L的Mn2+对重组酶促进作用最大,使其酶活力提高了约59%,终浓度为1mmol/L的Ca2+对其抑制作用最强,使其酶活力下降至43%。（2）利用PCR技术从硫磺矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus P2）中扩增得到内切甘露聚糖酶基因,并将其分别克隆至大肠杆菌表达载体pET-30α和硫化叶菌表达载体pZC2中,构建重组表达载体pET-30α-3007和pZC2-3007,并分别转化至E. coli Rosetta和S.islandicus E233S（△pyrEF△lacS）菌中。利用IPTG诱导重组菌株E.coli Rosetta/pET-30α-3007, SDS-PAGE检测表明目的蛋白大部分以包涵体形式存在且分子量大小为70 ku,与预测一致；对其进行包涵体复性后过Ni-NTA柱纯化得到目的蛋白3007-R。重组菌株S. islandicus E233S/pZC2-3007经D-阿拉伯糖诱导后,细胞破碎上清经Ni-NTA柱纯化,得到重组蛋白3007-S。酶学性质分析表明重组蛋白3007-R和3007-S均没有甘露聚糖酶活性,实验结果证实在此实验条件下Sso3007不具有NCBI上预测的甘露聚糖酶活性。质谱分析重组蛋白3007-S,结果表明基因序列均全部表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 硫化叶菌及穿梭质粒pZC2简介
• 1.1.1 古菌简介
• 1.1.2 硫化叶菌简介
• 1.1.3 穿梭质粒pZC2简介
• 1.2 大肠杆菌Rosetta的菌株表达系统及表达载体简介
• 1.3 β-1,4-葡聚糖酶及β-葡聚糖简介
• 1.3.1 β-葡聚糖
• 1.3.2 β-1,4-葡聚糖酶
• 1.3.3 β-葡聚糖酶的应用
• 1.4 β-甘露聚糖及甘露聚糖酶简介
• 1.4.1 β-甘露聚糖
• 1.4.2 β-甘露聚糖酶简介
• 1.4.3 甘露聚糖酶在工业中的应用
• 1.5 研究目的及内容
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 试剂与工具酶
• 2.1.3 培养基和部分溶液的配制
• 2.1.4 仪器设备
• 2.2 硫化叶菌基因组的提取
• 2.3 内切β-1,4-葡聚糖酶的研究
• 2.3.1 内切β-1,4-葡聚糖酶基因的克隆
• 2.3.2 表达载体的构建
• 2.3.3 内切β-1,4-葡聚糖酶表达与纯化
• 2.3.4 内切β-1,4-葡聚糖酶的酶学性质研究
• 2.4 甘露聚糖酶的研究
• 2.4.1 甘露聚糖酶基因的克隆
• 2.4.2 表达载体的构建
• 2.4.3 甘露聚糖酶在大肠杆菌中的表达与纯化
• 2.4.4 甘露聚糖酶在硫化叶菌中的表达与纯化
• 2.4.5 甘露聚糖酶的活性检测
• 2.4.6 重组蛋白的质谱检测
• 3 结果与分析
• 3.1 内切β-1,4-葡聚糖酶的研究
• 3.1.1 内切β-1,4-葡聚糖酶基因的克隆
• 3.1.2 表达载体的构建
• 3.1.3 内切β-1,4-葡聚糖酶基因的表达与纯化
• 3.1.4 内切β-1,4-葡聚糖酶的酶学性质研究
• 3.2 甘露聚糖酶的研究
• 3.2.1 甘露聚糖酶基因的克隆
• 3.2.2 表达载体的构建
• 3.2.3 甘露聚糖酶在大肠杆菌中的表达与纯化
• 3.2.4 甘露聚糖酶在硫化叶菌中的表达与纯化
• 3.2.5 重组蛋白的活性及质谱检测
• 4 讨论
• 4.1 硫化叶菌表达系统
• 4.2 内切β-1,4-葡聚糖酶的研究
• 4.3 甘露聚糖酶的研究
• 参考文献
• 附录
• Mascot Search Results
• Transetta（DE3）Chemically Competent Cell
• 致谢