Rhodococcus sp.R04联苯水解酶性质及反应动力学研究

论文摘要

多氯联苯（PCBs）是一种严重的环境污染物,它不断威胁着自然生态系统和人类健康。微生物治理多氯联苯环境污染具有环境破坏小、经济有效,且不会产生二次污染等特点而被人们广泛关注。水解酶BphD作为PCBs微生物降解途径中的关键酶,其结构和功能已成为该领域研究的热点。本文从一株联苯降解菌株Rhodococcus sp. R04的基因组中扩增水解酶基因bphD,并将其克隆到表达载体pBV220中,构建了重组质粒pBV220-bphD。表达产物经离子交换和凝胶排阻两步层析,最后获得了电泳纯的BphD, SDS-PAGE和分子排阻层析表明它是一个亚基分子量为31 kD的同源四聚体。在此基础上,对BphD的部分酶学性质以及其圆二色性进行初步研究,同时对几种金属离子、表面活性剂和抑制剂等因素对BphD的影响做了进一步的分析。结果显示BphD的最适反应温度和最适pH分别为80℃和9。该酶在60℃温浴1 h,酶活剩余90%,而在70℃温浴时,半衰期为1h,是迄今为止在有关红球菌的报道中唯一一例热稳定性高的水解酶。BphD的圆二色谱在208nm和222nm为典型的双负峰,表明该酶是一个以a-helix占主导的蛋白,当温度升高到70℃时,其二级结构发生了明显的变化,80℃时BphD的结构已经遭到严重的破坏。1 mmol/L的金属离子除Mn2+对BphD的活性有微弱促进作用之外,其它的对其活性均有不同程度的抑制,SDS对BphD的抑制作用也较为强烈。另外,该酶的金属依赖性不强,但其抗氧化能力相对较强。利用圆二色谱技术进一步探讨了BphD的热稳定性与其二级结构的关系,结果表明该酶活性的高低依赖于其二级结构的完整性。随着反应温度的不断升高,该酶的的二级结构逐渐遭到破坏,此时酶活性表现出逐渐下降的趋势。对几种同源水解酶的一级结构进行比对,发现Ser、His、Asp以及Trp在所有的水解酶中完全保守,另外还发现S46、G53、V65、A180、V207、S213和M252等位置的氨基酸与其它几种水解酶相同位置的氨基酸不同,是红球菌R04 BphD所特有的序列。对BphD这些保守氨基酸残基进行特异性地化学修饰,结果显示它们对酶活影响较大,推测它们很可能在催化过程中担任重要角色,或者位于酶的活性中心。为进一步确定BphD保守氨基酸及特有氨基酸的功能,分别对它们进行了定点突变和表达。此外,对BphD的稳态和前稳态动力学进行初步研究。以HOPDA作为底物时,BphD的Km为0.44μmol/L, kcat为2.8 s-1。儿茶酚类的物质不能作为BphD的底物；联苯类物质中HOPDA是最适底物,且BphD对氯代HOPDA的降解受到氯原子取代数目的影响。利用停流光谱技术跟踪了BphD对底物HOPDA的水解历程。底物HOPDA在反应之初迅速地消耗,最终达到恒定水平；酶-底物复合物在反应初始阶段迅速地生成,然后又急速地分解,最后逐渐趋于平衡；产物HPD随着反应时间的延长逐渐增多,并达到一个平衡状态,此时酶促反应达到稳态水平,整个反应符合典型的酶促反应动力学；且反应温度和酶浓度的升高都会加速各反应元件达到稳态水平。这为进一步研究水解酶的动力学机制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 联苯及其衍生化合物
• 1.1 芳香族化合物概述
• 1.2 联苯及其衍生物概况
• 1.3 联苯及其衍生物的危害及治理
• 2 联苯及多氯联苯的生物降解
• 2.1 联苯的生物降解
• 2.2 多氯联苯的生物降解
• 2.3 联苯及多氯联苯降解的上游酶系
• 3 HOPDA
• 3.1 HOPDA的产生和积累
• 3.2 HOPDA的生物转化工程
• 4 本论文研究的目的和意义
• 参考文献
• 第二章 联苯水解酶基因的克隆,表达和纯化
• 1 材料
• 1.1 菌株和载体
• 1.2 培养基
• 1.3 主要的酶和化学试剂
• 1.4 主要的仪器设备
• 2 方法
• 2.1 Rhodococcus sp.R04水解酶基因bphD的克隆
• 2.2 联苯水解酶的表达
• 2.3 联苯水解酶的纯化
• 2.4 酶活性分析及蛋白含量测定
• 3 结果
• 3.1 Rhodococcus sp.R04水解酶基因bphD的扩增及重组子鉴定
• 3.2 联苯水解酶的表达及纯化
• 4 讨论
• 参考文献
• 第三章 联苯水解酶的部分性质研究
• 1 材料
• 1.1 主要的化学试剂
• 1.2 主要的仪器设备
• 2 方法
• 2.1 最适pH和最适温度测定
• 2.2 pH稳定性和热稳定性测定
• 2.3 圆二色性分析
• 2.4 天然分子量的测定
• 2.5 金属离子、表面活性剂和抑制剂对BphD酶活性的影响
• 2.6 动力学参数的测定
• 3 结果
• 3.1 BphD最适温度和最适pH
• 3.2 BphD的pH稳定性
• 3.3 BphD的热稳定性
• 3.4 BphD的圆二色性
• 3.5 BphD的天然分子量
• 3.6 金属离子、表面活性剂和抑制剂对BphD活性的影响
• 3.7 BphD的动力学参数
• 4 讨论
• 参考文献
• 第四章 联苯水解酶的催化活性氨基酸分析及定点突变研究
• 1 材料
• 1.1 主要的酶和化学试剂
• 1.2 主要仪器设备
• 2 方法
• 2.1 Rhodococcus sp.R04 BphD与其同源水解酶的氨基酸系列比对
• 2.2 Rhodococcus sp.R04 BphD的化学修饰
• 2.3 联苯水解酶的定点突变
• 2.4 突变体重组质粒的构建
• 2.5 BphD突变体的表达
• 3 结果
• 3.1 水解酶一级结构序列比对
• 3.2 BphD的化学修饰
• 3.3 BphD的定点突变及突变体的表达
• 4 讨论
• 参考文献
• 第五章 联苯水解酶反应动力学研究
• 1 材料
• 1.1 菌株来源
• 1.2 试剂与仪器
• 1.3 培养基
• 2 方法
• 2.1 2,3-二羟基联苯双加氧酶的制备
• 2.2 联苯水解酶的制备
• 2.3 BphD稳态动力学数据测定
• 2.4 BphD的底物特异性分析
• 2.5 BphD非稳态动力学研究
• 3 结果与讨论
• 3.1 BphD稳态动力学分析
• 3.2 BphD非稳态动力学分析
• 4 展望
• 参考文献
• 小结
• 攻读学位期间取得的研究成果
• 致谢
• 个人简况及联系方式