论文摘要
研究背景目前临床上开展的组织器官移植中绝大多数属于无血缘关系供受体之间的同种异体移植。由于人类HLA系统为高度多态性,在人群中难以找到与受体HLA完全相同的供者,因此同种异体器官移植都有可能发生排斥反应。为了减少排斥反应、提高移植成功率、延长移植物有功能存活,移植前严格进行组织配型,对供受者进行免疫学选配就非常重要。移植供受体选择的免疫学因素包括：①ABO血型相容原则；②HLA配型；③交叉细胞毒试验；④群体反应性抗体检测。人类白细胞抗原（human leukocyte antigen, HLA）被称为移植基因,HLA组织配型包括：①HLA抗原分型；②HLA抗体分析,即对群体反应性HLA抗体的识别（panel reaction antibody, PRA）和抗供者特异性HLA抗体的分析（complement-dependent cytotoxicity, CDC）。检测受者血清中HLA抗体特异性（PRA）用以识别受者不能接受的HLA抗原,检测受者血清中特异性抗供者HLA的抗体（CDC）用以识别受者可以接受的HLA抗原。CDC是肾移植术前、术后主要的组织相容性实验之一,是移植前供受体选择的最重要的免疫学实验,对预防超急性及加速性排斥反应、监测受者免疫状态、减少免疫抑制剂毒副作用及提高移植肾及移植受者近远期有功能存活率有重要意义,CDC阳性被认为是移植的绝对禁忌症。移植前受者体内如果存在抗供者特异性抗体（donor specific anti-HLA antibodies, DSA）,抗体介导的排斥反应（AMR）极有可能导致移植肾的早期失功。病人的循环抗体水平会随血液透析频率、效果而波动变化以及/或病人接受了输血或其它形式（再次移植、妊娠）的致敏,即使用病人当前血清进行移植前交叉配型为阴性,但由于病人存在记忆性免疫应答,仍会引起超急性排斥和（或）早期移植肾失功,因此有必要对移植术后受者血清进行连续监测。目前用于CDC的方法主要包括补体依赖淋巴细胞毒交叉配型方法（NIH-CDC）和流式细胞交叉配型方法（FCXM）, CDC结果为阳性时也可能获得较好的移植肾/受者近远期有功能存活率；相反地,CDC结果为阴性时,移植肾也可能发生早期失功。NIH-CDC和FCXM的实验结果与移植后效果常不相符,其可靠性欠佳,ELISA-PRA能更准确地反映受者体内的致敏情况,PRA强度与移植肾存活率有关,但ELISA-PRA检测出的抗体不一定是针对供者的特异性抗体。目前研究表明ELISA法比CDC法在检测HLA抗体中有较强的敏感性和特异性,ELISA法具有测定结果客观,重复性好；只能检测特异性抗HLA-IgG抗体,不受其他抗体的干扰；既可测定补体结合的HLA抗体,也可测定非补体结合的HLA抗体；不需要活的淋巴细胞,大大方便了临床应用等优势,被认为是目前HLA抗体筛选技术的“金标准”。目前国内外许多器官移植中心倾向于在移植术前分别采用两种交叉配型方法检测,以提高对DSA的识别能力,预防严重排斥反应的发生,常用的组合包括NIH-CDC+AHG-CDC或NIH-CDC+FCXM等,因此建立一种新的交叉配型方法也方便临床上根据需要选择。因此可以考虑依据ELISA原理建立一种新的CDC实验方法,以更好地预测排斥反应。目的为了提高对DSA识别的敏感性和特异性,为移植术前、术后提供一种DSA的监测方法,更好地预测排斥反应,本研究利用国内各器官移植实验室已有的组织配型实验条件,不需增加特殊实验设备,创新性建立ELISA-CDC实验技术,对已知HLA抗体特异性的PRA阳性血清进行ELISA-CDC实验,以比较ELISA-CDC与ELISA-PRA在同一特异性HLA抗体识别上的吻合率,探讨其在移植前供受者交叉配型及移植术后监测DSA中的应用价值,并对2010年1月～2010年12月间接受同种异体肾脏移植受者以NIH-CDC阴性为移植入选标准,当NIH-CDC为阴性时,若ELISA-CDC阳性则排除患者接受此器官,密切观察受者移植术后的病情变化,注意有无超急性排斥反应或加速性排斥反应的发生。方法1、研究对象1.1实验方法的建立（1）供者淋巴细胞的提取和淋巴细胞裂解物的制备；（2）实验质控系统的建立：试剂质控、溶解质控和阴性质控,用酶标仪读取吸光度A值,通过对比阴性对照的OD值来确定阳性标本和阴性标本；（3）依据ELISA原理,特异性检测HLA-IgG抗体。1.2实验方法的验证1.2.1标本的采集所有标本选自5例已知HLA基因的淋巴细胞和24例已知HLA抗体特异性的ELISA-PRA阳性血清。24例已知HLA抗体的PRA阳性血清分为95份分别和针对性HLA-A、B、DR基因的淋巴细胞为第一组,其中与相应针对性HLA-A、B基因淋巴细胞的为51份,与针对性HLA-DR基因的淋巴细胞的为44份；24份已知HLA抗体的血清和无针对性HLA-A、B、DR基因的淋巴细胞为第二组,其中与无相应针对性HLA-A.B基因的淋巴细胞的为13份,与无针对性HLA-DR基因的淋巴细胞的为11份；35份PRA-Ⅰ类或Ⅱ类阴性血清为阴性对照组,其中PRA-Ⅰ类阴性的为20份,PRA-Ⅱ类阴性的为15份。1.2.2统计结果的处理采用SPSS13.0统计软件数据包对所有数据进行记录分析,两种检测方法之间采用配对χ2检验（McNemar）。两种检测方法之间吻合度行Kappa检验。P≤0.05判断为差异具有统计学意义。1.3临床移植受者的观察和统计1.3.1临床移植受者的观察对2010年1月～2010年12月间接受同种异体肾脏移植受者以NIH-CDC阴性为移植入选标准,当NIH-CDC为阴性时,若ELISA-CDC阳性则排除患者接受此器官。密切观察受者移植术后的病情变化,注意有无超急性排斥反应或加速性排斥反应的发生。1.3.2统计结果的处理采用SPSS13.0统计软件数据包对所有数据进行记录分析,PRA阳性组和阴性组之间采用两个独立样本率比较的χ2验。P≤0.05判断为差异具有统计学意义。2、实验方法2.1捕获抗原：用淋巴细胞分离液从供者静脉血中分离出淋巴细胞,再用淋巴细胞裂解液裂解,分装后立即使用或放入-80℃温度下保存。2.2 ELISA实验：从4℃冰箱中取出所有试剂,平衡至室温,取出板条,记录纸上标记阴性对照、裂解物对照、阳性对照及空白孔的位置。测Ⅰ类抗体的裂解液用裂解和耦联稀释液（LCD）8倍稀释,测Ⅱ类的用LCD 4倍稀释,干淋巴细胞对照裂解物用LCD 4倍稀释。除指定作为阳性对照孔和空白对照孔外,其余各孔均加入已稀释的供者淋巴细胞裂解物15ul,阳性对照孔中加入“对照细胞裂解物”,空白孔不加任何试剂,37℃温箱孵育30min,取出甩干,洗板4次。用标本稀释液（SD）1：3稀释受者血清和阴、阳性对照,相应孔内加入已稀释血清15ul,裂解物对照孔中加入15ulLCD,37℃温箱孵育30min,取出甩干,洗板4次。用SD1：100稀释Anti-IgG抗体,用LCD 1：100稀释裂解对照试剂LCR1和LCR2,除空白和裂解物对照孔外,每孔各加15ul已稀释的Anti-IgG抗体,Ⅰ类和Ⅱ类裂解物对照孔分别加入已稀释的LCR1、LCR2各15ul,置37℃温箱孵育30分钟,取出甩干,洗板4次。用0.5ml去离子水溶解对硝基苯磷酸（PNPP）粉末,每一条加0.5ml酶底物溶液和5ul PNPP溶液,除空白孔外,每孔加已稀释的酶底物溶液50ul,22-25℃避光反应30min,各孔加入50ul终止液,空白对照孔加100ul终止液。30min内在波长为405nm的酶标仪上读取吸光度A值。2.3结果判断与分析通过对比阴性对照的OD值来鉴定阳性及阴性标本。根据在波长为405nm的酶标仪上读取吸光度A值,样本检测值≥2倍阴性对照值,则判为阳性；样本检测值<2倍阴性对照值,则判为阴性。结果1、实验方法的建立：（1）淋巴细胞的裂解产物可以置于-80℃冷冻保存,以供2年内使用,可作回顾性淋巴细胞毒交叉配型实验和移植术后免疫学监测；（2）实验时间：平均每次ELISA-CDC需时2.5～3h；（3）实验的整套检测系统包括3套质控：试剂质控、溶解质控和阴性质控,用酶标仪读取吸光度A值,结果稳定客观；（4）测定结果：ELISA测定显示裂解物对照孔A值>0.900,表明足量的HLA糖蛋白已被捕获；试剂对照孔A值>1.000,说明试剂系统工作正常;阴性对照孔A值<0.300；（5）从供者的淋巴细胞裂解物中提取HLA-I类和Ⅱ类抗原,并借助特异性单克隆抗体将其固化在ELISA板上,与受者血清进行酶联免疫吸附反应,特异性检测HLA-IgG抗体,IgM、IgA抗体和非特异性抗供者HLA-IgG抗体会因不结合而被洗掉,排除了非HLA抗体、非IgG类抗体和非供者特异性抗体的影响；（6） ELISA-CDC使用的是供者淋巴细胞的裂解产物,不受淋巴细胞活力影响；（7）一种裂解产物能分别检测出特异性的HLA-Ⅰ、Ⅱ类抗体,在强Ⅰ类抗体存在时能检测到Ⅱ类抗体;（8）既能检测补体结合抗体,也能检测非补体结合抗体。2、实验方法的验证：选自ELISA-PRA阳性血清,24例已知HLA抗体的血清分为95份分别和针对性HLA-A、B、DR基因的淋巴细胞ELISA-CDC实验为第一组,其中与针对性HLA-A、B基因的淋巴细胞的为51份,与针对性HLA-DR基因的淋巴细胞的为44份,实验结果均为阳性；24份已知HLA抗体的PRA阳性血清和无针对性HLA、B、DR基因的淋巴细胞ELISA-CDC实验为第二组,其中与无针对性HLA-A、B基因的淋巴细胞的为13份,与无针对性HLA-DR基因的淋巴细胞的为11份,实验结果均为阴性；35份PRA-Ⅰ类或Ⅱ类阴性血清与上述2组淋巴细胞ELISA-CDC实验为阴性对照组,其中PRA-Ⅰ类阴性的为20份,PR A-Ⅱ类阴性的为15份,实验结果亦为阴性。ELISA-CDC与ELISA-PRA对同一特异性HLA抗体的识别采用配对χ2检验（McNemar）, P=1.000,表明ELISA-C DC与ELISA-PRA对同一特异性HLA抗体的识别的差异无统计学意义。两种检测方法之间的吻合度行Kappa检验,Kappa=1.000, P<0.001,表明两种方法的吻合度有统计学意义,且吻合度极强。3、临床移植受者的观察：以NIH-CDC阴性为肾脏移植入选标准,当NIH-CDC为阴性时,若ELISA-CDC阳性则排除患者接受此器官。期间共有101例受者接受了同种异体肾脏移植,其中男性74例,女性27例；PRA阴性85例,PRA阳性16例。密切观察移植受者术后的病情变化,PRA阴性受者和PRA阳性受者移植术后均未发生超急性排斥反应或加速性排斥反应。PRA阳性组和阴性组之间采用两个独立样本率比较的χ2检验,P=1.000,表明PRA阳性组和阴性组之间发生排斥反应的差异无统计学意义。结论目前用于CDC的方法的实验结果与移植后效果常不相符,其可靠性欠佳,ELISA-PRA能更准确地反映受者体内的致敏情况。ELISA-CDC和ELISA-PRA均是依据ELISA原理,排除了非HLA抗体和非IgG类抗体的影响。ELISA-CDC能够表达出与ELISA-PRA一致的HLA抗体特异性。在方法学上,ELISA-CDC具有比NIH-CDC敏感性高,比FCXM准确性高的优势。虽然PRA强度与移植肾存活率有关,但ELISA-PRA检测出的抗体不一定是针对供者的特异性抗体,ELISA-CDC是从供者的淋巴细胞裂解产物中提取HLA抗原,排除了非供者特异性抗体的影响。ELISA-CDC较目前用于CDC的实验方法还具有如下优势：ELISA-CDC使用的是供者淋巴细胞的裂解产物,不受细胞活力影响；ELISA-CDC结果稳定而客观,有可能实现检测过程的自动化；一种裂解产物能分别检测出特异性的Ⅰ、Ⅱ类抗体,在强Ⅰ类抗体存在时能检测到Ⅱ类HLA抗体；治疗性免疫抑制剂不会影响结果;ELISA-CDC可以提纯供者HLA抗原低温长期保存,不仅便于移植前多个受者与单一供者交叉配型,而且便于移植术后使用同一供者HLA基因进行监测DSA。ELISA-CDC可能比较准确地反应了受者体内的致敏状态,当NIH-CDC为阴性时根据ELISA-CDC阳性排除此病人接受此器官移植,可有效地降低超急性和加速性排斥反应的发生率,为移植受者特别是PRA阳性受者寻找合适的供体提供了一种较为可靠的交叉配型方法。此外,ELISA-CDC操作简单易行,耗时也不长。当HLA特异性不确定或者目前CDC方法的阳性结果需要进一步证实时,ELISA-CDC的结果也可以做为重要的参考依据。ELISA-CDC在移植前供受者交叉配型及移植术后监测DSA中均具有一定的优势,在临床上有推广价值。本研究中ELISA-CDC实验结果与ELISA-PRA完全吻合,可能与样本量不足有关,所以进一步的研究可以考虑加大样本量。本研究仅进行了ELISA-CDC与ELISA-PRA的吻合率比较,及观察术前ELISA-CDC阴性受者术后有无超急性排斥反应或加速性排斥反应的发生,暂时未将ELISA-CDC方法应用于移植术后的监测,观察其实验结果与移植物功能及预后的关系,下一步可继续此方面的相关研究。
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