单环刺螠（Urechis unicinctus）受精过程的细胞学观察和硫氰酸酶基因的克隆与表达

论文摘要

本论文包括两部分,第一部分是单环刺螠受精过程的细胞学研究,第二部分是单环刺螠硫氰酸酶基因的克隆及表达。受精标志着生物新个体的诞生,在生物体内,它是单倍体的精子和卵子相互结合而启动胚胎发育的过程。本文第一部分利用组织学和荧光显微镜对单环刺螠（Urechis unicinctus）受精过程中精子入卵以及核相变化进行了观察。结果表明:单环刺螠成熟卵呈卵圆形,核相处于生发泡尚未破裂的第1次成熟分裂前期。在（21±1）℃的条件下,精卵混合后约5 min,精子由卵偏向植物极一侧入卵,受精膜开始举起,继而精核发生第1次膨胀。直至受精后25 min左右,受精膜完全举起;受精后10-50 min,卵核相继完成2次成熟分裂,分别形成第一极体和第二极体;受精后50-70 min,精核卵核分别膨胀,形成雄原核和雌原核,进而相向迁移,最后在卵的中央联合形成合子核。受精后70-90 min,受精卵完成第1次卵裂,形成两个大小相等的卵裂球。单环刺螠受精全过程历时约70 min,略长于多数海洋无脊椎动物的受精持续时间。本研究对单环刺螠受精过程的观察,丰富了单环刺螠受精生物学的基础资料内涵,也为其人工育苗和未来的新品种的培育提供理论基础。本文的第二部分内容是克隆了单环刺螠硫氰酸酶全长cDNA序列,并对其在硫化物应急下的组织表达特性进行了分析。硫氰酸酶（rhodanese）又称硫转移酶（sulfurtransferase）,是线粒体硫化物氧化解毒酶系中的最后一个成员,转移一个过硫化物分子到亚硫酸盐形成终产物硫代硫酸盐。采用同源克隆和RACE技术获得单环刺螠硫氰酸酶全长cDNA 2318 bp,其开放阅读框长870 bp,编码289个氨基酸,含有保守氨基酸序列（CEVGVT）及保守的催化活性位点Cys 230。荧光定量PCR分析该基因在单环刺螠各组织中的表达量存在差异,其中肛门囊表达量最高,呼吸肠和中肠次之,体腔液细胞和体壁表达量最低;进一步的硫化物诱导表达结果显示,单环刺螠呼吸肠硫氰酸酶mRNA在硫化物暴露（50μM和150μM）72 h内较对照均无显著性差异。本研究成果为深入探讨硫化物代谢的分子机制以及开发单环刺螠成为沿海硫化物代谢研究的模式生物提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一部分 单环刺螠（Urechis unicinctus）受精过程的细胞学观察
• 第一章 前言
• 1 受精作用的发现、意义
• 2 精子的入卵方式
• 2.1 精子由受精孔入卵
• 2.2 精子与卵子表面受体结合后入卵
• 3 本受精生物学的研究现状
• 4 单环刺螠的研究概况
• 4.1 单环刺螠的分布及进化地位
• 4.2 单环刺螠的形态结构研究
• 4.3 单环刺螠的应用价值研究
• 4.4 单环刺螠繁殖生物学相关研究
• 4.5 单环刺螠硫化物耐受的相关研究
• 4.6 其它方面的研究
• 5 本研究的目的和意义
• 第二章 单环刺螠受精过程的细胞学观察
• 1 材料与方法
• 1.1 实验动物
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 卵母细胞成熟时的核相及精子入卵
• 2.2 极体的排放
• 2.3 雌雄原核的形成与结合
• 2.4 第一次卵裂
• 3 讨论
• 3.1 卵子的成熟时间
• 3.2 雌雄原核的结合方式
• 3.3 组织学方法和荧光显微镜观察方法的比较
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 单环刺螠硫氰酸酶基因的克隆及表达
• 第一章 生物对硫化物的代谢适应
• 1 硫化物对生物的毒性以及生物对硫化物的解毒机制
• 1.1 硫化物对生物的毒性
• 1.2 生物对硫化物的氧化解毒机制
• 2 硫氰酸酶的研究进展
• 2.1 硫氰酸酶的发现和分布
• 2.2 精硫氰酸酶的保守序列
• 2.3 硫氰酸酶三维结构
• 2.4 硫氰酸酶的生理功能
• 3 本研究的目的和意义
• 第二章 单环刺螠硫氰酸酶的基因克隆及对富硫环境的适应
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 单环刺螠硫氰酸酶全长cDNA 序列的获得
• 2.2 单环刺螠硫氰酸酶cDNA 序列特征
• 2.3 硫氰酸酶蛋白序列相似性比较和系统进化分析
• 2.4 单环刺螠硫氰酸酶蛋白的生物信息学预测
• 2.5 单环刺螠硫氰酸酶mRNA 组织表达
• 2.6 硫化物暴露下单环刺螠呼吸肠硫氰酸酶mRNA 表达
• 3 讨论
• 3.1 单环刺螠硫氰酸酶基因的序列特性
• 3.2 单环刺螠硫氰酸酶mRNA 表达
• 小结
• 参考文献
• 致谢
• 个人简介
• 发表与待发表的文章