胸膜肺炎放线杆菌内生质粒和温敏复制型质粒的研究

论文摘要

胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）是巴氏杆菌科中重要的病原菌,它引起猪的一种高度接触性传染呼吸道疾病—猪传染性胸膜肺炎（porcinecontagious pleuropneumonia,PCP）。该病分布广泛,难以根除,给世界养猪业造成了巨大的经济损失。因此,预防和控制该疾病尤其重要。然而APP血清型众多（目前已经发现有15种血清型）,并且不同血清型之间的交叉保护力较低,对该病的预防控制和治疗带来了极大的困难。而且许多国家用大量不同的抗生素来预防和治疗猪传染性胸膜肺炎,致使许多病原菌（包括APP）产生了极强的抗药性,这对该病的预防和治疗更是雪上加霜。现阶段,为了解决APP的预防和治疗问题,需要对APP的毒力因子、毒力相关因子以及膜蛋白和鞭毛等进行分子生物学研究。但研究这些基因和相关因子的前提是要具备相应的遗传操作工具,如穿梭载体,高效的突变体构建平台等,为技术支持。本文主要对APP的遗传操作工具的研究,包括以下两个方面内容:1.胸膜肺炎放线杆菌内生质粒pHB0503分析质粒pHB0503分离于2005年的胸膜肺炎放线杆菌地方分离菌株HB0503。大小为15.079kb,含有16个ORF,其中7个是抗性基因（sul2,catA3,aacC2,strA,strB’,blaROB-1和aph（3）-I）。对这些抗性基因簇序列的生物信息分析,来研究该抗生素簇的进化和结构组成。实验数据分析表明该质粒可能在来源不同的质粒间,发生了同源重组而形成的。另外,RT-PCR实验证明:两处抗性基因簇的共转录,分别从sul2和blaROB-1启动子开始地。对该质粒的复制蛋白的分析,有可能在此基础上构建在APP中能稳定复制地穿梭载体和遗传操作系统,为进一步从分子生物学水平研究胸膜肺炎放线杆菌提供技术支持。而且对内生质粒抗性基因的研究,对临床抗生素的使用也有指导意义。2.胸膜肺炎放线杆菌温敏复制型质粒的构建PCR定向突变系统是新型的高效遗传操作体系,已经广泛应用于微生物学研究。构建该系统至少需要重组酶系统、抗性基因PCR模版、诱导型启动子、温敏复制型质粒等四大要件。本实验室已经拥有前三大要件,缺乏APP的温敏复制型质粒。为了构建一个APP的温敏复制型质粒,本研究以APP-E.coli穿梭质粒pJN105和pR318为出发质粒,采用低保真度PCR基因扩增和修复系统缺陷型E.coli感受态细胞基因克隆两种途径筛选温敏复制元件,为构建温敏复制载体奠定基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表（Abbreviation）
• 第1章 文献综述
• 1.1 胸膜肺炎放线杆菌（APP）及其危害
• 1.1.1 胸膜肺炎放线杆菌的发现史
• 1.1.2 胸膜肺炎放线杆菌的特征
• 1.1.3 胸膜肺炎放线杆菌的毒力
• 1.1.4 胸膜肺炎放线杆菌的危害
• 1.2 细菌内生质粒的基本特征
• 1.2.1 质粒的类型
• 1.2.2 质粒的复制方式
• 1.2.3 质粒的拷贝数和拷贝数的控制
• 1.2.4 质粒拷贝数的测定
• 1.2.5 质粒的不相容性
• 1.2.6 质粒的不稳定性
• 1.3 胸膜肺炎放线杆菌的内生质粒
• 1.4 胸膜肺炎放线杆菌突变体构建方法
• 1.4.1 自然突变
• 1.4.2 化学诱变
• 1.4.3 转座子突变
• 1.4.4 同源重组
• 1.5 PCR定向突变系统的研究进展
• 1.5.1 PCR定向突变系统的组成
• 1.5.2 PCR定向突变系统的发展
• 1.5.3 PCR定向突变系统的优点
• 第2章 胸膜肺炎放线杆菌内生质粒的研究
• 2.1 研究目的和意义
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌株和质粒
• 2.2.2 寡核甘酸引物
• 2.2.3 培养基和抗生素
• 2.2.4 主要酶以及试剂盒来源
• 2.2.5 使用溶液及储存液
• 2.2.6 蛋白质纯化缓冲液
• 2.2.7 电泳迁移实验缓冲液
• 2.2.8 其他试剂
• 2.2.9 主要实验仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 APP药敏实验
• 2.3.2 抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）
• 2.3.3 DNA的操作
• 2.3.4 RNA的操作
• 2.3.5 质粒的转化及转化子的鉴定
• 2.3.6 胸膜肺炎放线杆菌内生质粒序列拼接、测序和注释
• 2.3.7 质粒拷贝数的鉴定
• 2.3.8 质粒稳定性研究
• 2.3.9 质粒消除菌株的筛选
• 2.3.10 蛋白质操作
• 2.4 结果和分析
• 2.4.1 APP的抗药性分析和APP质粒的提取
• 2.4.2 质粒pHB0503的拼接和测序
• 2.4.3 内生质粒pHB0503的概述
• 2.4.4 内生质粒pHB0503序列的分析
• 2.4.5 内生质粒pHB0503的抗性基因来源和共转录分析
• 2.4.6 内生质粒pHB0503拷贝数和稳定性
• 2.4.7 质粒pHB0503的复制蛋白的分析
• 2.5 讨论
• 2.5.1 胸膜肺炎放线杆菌耐药性
• 2.5.2 pHB0503抗性基因簇的来源
• 2.5.3 质粒pHB0503的稳定性
• 2.5.4 pHB0503复制蛋白和EMSA
• 2.6 结论与展望
• 第3章 胸膜肺炎放线杆菌温敏复制型质粒的研究
• 3.1 研究目的和意义
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 菌株和质粒
• 3.2.2 寡核甘酸引物
• 3.2.3 培养基
• 3.2.4 主要试剂
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 细菌PCR模板制备
• 3.3.3 PCR扩增
• 3.3.4 质粒的转化及转化子的鉴定
• 3.3.5 复制原点突变体库的建立
• 3.3.6 APP的质粒提取
• 3.3.7 温敏型载体的筛选
• 3.3.8 质粒的稳定性
• 3.4 实验结果和分析
• 3.4.1 pMIDG301复制原点预测、克隆和验证
• 3.4.2 用低保真Taq DNA聚合酶扩增法筛选温敏型穿梭载体
• 3.4.3 用修复系统缺陷型菌株（XL1-RED）筛选温敏型穿梭载体
• 3.5 讨论
• 3.5.1 pMIDG301的复制区域的分析和验证
• 3.5.2 筛选温敏型穿梭载体
• 3.6 结论和展望
• 参考文献
• 致谢
• 附录