水稻类生长素运输蛋白PIN基因的克隆及功能鉴定

论文摘要

植物生长素作为一种重要的植物激素,参与了许多生理生化过程的调节与控制。如根的伸长生长和向地性、不定根的形成、维管组织的分化、顶端优势、形成层的细胞分裂、细胞的伸长生长、植物向性等。植物体内生长素的运输是一个需要能量的主动运输过程,它的极性运输是一个非常复杂的问题,在植物体的不同部位其运输方式也不同。在胚芽鞘和茎尖生长素是向下运输,在根部是向根尖运输。目前已知的植物激素中只有生长素具有极性运输这一特征。造成这种极性运输的原因是由于在运输生长素的细胞中生长素输出蛋白在质膜上的极性分布所致。很多研究已表明,生长素的运输蛋白在植物的胚后发育过程及植物的光形态建成和组织分化方面起着非常重要的作用。水稻是世界上最重要的粮食作物之一,也是禾谷类作物发育生物学研究的模式植物。我们在前期研究的基础上,成功地克隆了水稻中一推测的生长素运输蛋白基因（PINp）的启动子及cDNA。并且构建了两个表达载体,分别命名为p1300-promotor::GUS和p1300-cDNA,前者用于该PIN（p）基因组织表达定位;后者用于该基因功能的鉴定。构建完成的双元表达载体通过农杆菌介导的方法转化水稻,经共培养、选择培养、分化培养后得到T0代转基因植株。转基因过程中对愈伤组织状态调控和农杆菌转化水稻的各个参数进行优化。结果表明:当农杆菌侵染浓度OD600为0.1-0.15,共培养时间为3-5天时,转化效率比较高;愈伤组织共培养后充分洗涤并进行干燥处理能够有效地抑制农杆菌的生长;接种前的低温处理和适当的干燥处理可提高水稻愈伤组织的分化率。对于转化p1300-promoter::GUS表达载体得到的T0代转基因植株进行了GUS染色,初步鉴定了Os PINp基因的组织表达模式。该基因在水稻幼苗的幼芽、幼茎、根、胚芽鞘、叶迹微管束以及叶片中均有表达,但在各个器官中表达的丰度有较大的差别:在生长素合成部位,如幼芽、幼茎中的表达量比较高,在胚芽鞘、叶迹微管束、根的伸长区及叶片中只有微量的表达。由此我们推测,该基因的这种表达模式与基因的功能相关。同时,又将构建好的p1300-cDNA表达载体转化野生型和突变体水稻,进一步验证该基因的功能。

论文目录

• 目录
• 缩写表
• 摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 文献综述
• 第一章 生长素的极性运输及其在植物发育调控中的作用
• 1.1 生长素
• 1.2 生长素的极性运输
• 1.2.1 生长素极性运输的生理特点
• 1.2.2 生长素极性运输的机理
• 1.3 生长素极性运输的调控
• 1.3.1 调控输出和和输入蛋白在质膜上的分布
• 1.3.2 调控输出和输入蛋白基因的表达
• 1.4 生长素极性运输及其在植物生长和发育调控中的作用
• 1.4.1 生长素的极性运输与胚胎发育
• 1.4.2 生长素的极性运输与光形态建成
• 1.4.3 生长素的极性运输与侧根的发育
• 1.5 生长素运输蛋白的研究进展
• 第二章 水稻功能基因组学研究进展与方法
• 2.1 新基因的发现
• 2.1.1 基于图谱的克隆
• 2.1.2 E-PCR
• 2.2 基因产物的表达分析
• 2.2.1 高通量基因表达谱分析
• 2.2.2 利用蛋白组学方法进行的基因功能分析
• 2.3 水稻基因的功能鉴定
• 2.3.1 转座子标签技术
• 2.3.2 T-DNA插入标签法
• 第三章 农杆菌介导的水稻的遗传转化
• 3.1 水稻遗传转化方法
• 3.1.1 花粉管通道法
• 3.1.2 原生质体直接导入法
• 3.1.3 基因枪法
• 3.1.4 农杆菌介导法
• 3.2 农杆菌介导法转化水稻的研究现状
• 3.2.1 农杆菌介导的遗传转化的机理
• 3.2.2 农杆菌介导的遗传转化的优越性
• 3.3 农杆菌介导法转化水稻的影响因素
• 3.3.1 水稻基因型
• 3.3.2 外植体
• 3.3.3 农杆菌菌株与载体类型
• 3.3.4 共培养条件
• 3.4 表达载体构建
• 3.4.1 启动子
• 3.4.2 终止子
• 3.4.3 报告基因
• 3.4.4 标记基因
• 第四章 研究的目的和内容
• 第二篇 研究报告
• 第一章 表达载体（p1300-P26-GUS、p1300-35SP-26CDNA）的构建
• 1.1 材料和试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 日本晴基因组DNA的提取
• 1.2.2 PCR引物设计与目的片段扩增
• 1.2.3 P26和26cDNA片断测序
• 1.2.4 双元表达载体的构建
• 1.2.5 双元表达载体转化农杆菌
• 1.3 实验结果
• 1.3.1 目的基因的扩增与测序
• 1.3.2 双元表达载体的构建
• 1.3.3 双元表达载体转化农杆菌
• 第二章 农杆菌介导p1300-P26-GUS、p1300-35SP-26cDNA转化水稻
• 2.1 材料和试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 种子灭菌
• 2.2.2 收集胚性愈伤
• 2.2.3 农杆菌的培养
• 2.2.4 共培养
• 2.2.5 选择培养
• 2.2.6 预分化及分化培养
• 2.2.7 壮苗培养
• 2.2.8 各种培养基列表
• 2.2.9 转基因植株的GUS染色和PCR鉴定
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 水稻转化生长状态
• 2.4.2 转基因（p1300-P26-GUS）植株的GUS染色
• 2.4.3 转基因（p1300-P26-GUS）植株的PCR鉴定
• 第三章 讨论
• 3.1 表达载体（p1300-P26-GUS、p1300-35SP-26cDNA）的构建
• 3.2 农杆菌介导p1300-P26-GUS、p1300-35SP-26cDNA转化水稻
• 3.2.1 愈伤状态的调控
• 3.2.2 共培养培养条件的优化
• 3.2.3 如何增强抑菌效果
• 3.3 转基因水稻的鉴定
• 3.3.1 GUS报告基因的选择
• 3.3.2 转基因水稻GUS的表达
• 第四章 结论和需要进一步解决的问题
• 4.1 结论
• 4.2 需要进一步解决的问题
• 参考文献
• 附录 主要培养基母液及贮存液配制
• 致谢
• 个人简历