小油桐组织培养及ipt基因遗传转化研究

论文摘要

小油桐（Jatropha curcas L.）属大戟科（Euphorhiaceae）麻疯树属（Jatropha）落叶灌木或小乔木,目前因其种子含油量较高而备受关注。本实验以小油桐为研究对象,建立了高效的组织培养再生体系,并在此基础上建立了农杆菌介导小油桐遗传转化体系,优化了遗传转化技术参数,将细胞分裂素合成限速酶——异戊烯基转移酶基因（ipt）导入小油桐基因组中,并对转基因小油桐植株的生理特性进行检测,初步筛选出抗寒性增强的小油桐植株。其主要研究内容如下:1.小油桐高效组织培养再生体系的建立本研究在MS+6-BA1.0mg·L-1培养基上培养小油桐无菌苗,以苗龄12d的无菌苗子叶为外植体,MS+6-BA 3.0mg·L-1+IBA 0.2mg·L-1为愈伤组织和再生芽最佳诱导培养基,愈伤组织诱导率为100%,再生芽诱导率为95.8%;以苗龄30d无菌苗的真叶为外植体,MS+6-BA1.0mg·L-1+IBA 0.5mg·L-1为小油桐真叶最佳诱导培养基,愈伤组织诱导率为100%,再生芽诱导率为85.0%;以苗龄30d的无菌苗真叶柄为外植体,MS+6-BA1.0 mg·L-1+IBA0.2 mg·L-1对小油桐真叶柄的愈伤组织诱导率为100%,再生芽诱导率为100%;不定芽增殖和壮苗培养以MS+6-BA 1.0mg·L-1为最佳,不定芽增殖倍数为2.9。最佳生根培养基为1/2MS+IBA0.5mg·L-1,生根率为82.4%。移栽基质为泥土:珍珠岩=2:1中,成活率为80%。2.农杆菌介导小油桐子叶遗传转化以小油桐子叶为受体的根癌农杆菌遗传转化研究体系:确定分化时Kan的有效筛选浓度为30 mg·L-1,生根时Kan的有效筛选浓度为10 mg·L-1;确定头孢霉素（Cef）浓度为150mg·L-1。详细探讨了外植体预培养时间、浸染菌液浓度、浸染时间、共培养时间等影响因素对转化效率的影响。结果表明,以小油桐种子在MS+6-BA 1.0 mg·L-1萌发12d的无菌苗子叶为外植体,接入MS+6-BA3.0 mg·L-1+IBA0.2mg·L-1中,25℃暗箱中预培养2d,OD600值0.6-0.8菌液浸染10min,无菌纸吸去多余菌液后接入MS+6-BA 3.0mg·L-1+IBA 0.2mg·L-1培养基,暗箱共培养3d,MS+6-BA3.0 mg·L-1+IBA0.2mg·L-1Kan 30 mg·L-1+Cef 150 mg·L-1脱菌和筛选培养。GUS染色和PCR检测初步证明ipt基因已整合到小油桐基因组中。3.转ipt基因小油桐生理生化研究本研究将转基因小油桐与对照于4℃处理72h,分析测定了低温处理前后转基因小油桐的生理特性。结果表明:低温处理前,目的基因的导入对小油桐叶片的主要生理指标影响不大,但低温处理后,转基因小油桐叶片叶绿素含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量较对照高,POD活性降低速率低于对照,这些生理特性表明ipt基因的表达有利于小油桐抵抗低温不良环境。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 异戊烯基转移酶基因ipt及其基因工程研究进展
• 1.1 细胞分裂素研究进展
• 1.2 ipt基因的发现
• 1.3 ipt基因的研究进展
• 1.4 ipt基因作为标记基因
• 2 植物基因工程研究进展
• 2.1 植物遗传转化方法
• 2.2 农杆菌Ti质粒或Ri质粒介导法
• 2.3 基因枪法
• 3 植物抗寒基因工程研究进展
• 3.1 概述
• 3.2 冷诱导基因
• 3.3 抗冻蛋白基因
• 3.4 调控基因
• 3.5 脂肪酸去饱和酶基因
• 3.6 超氧化物歧化酶基因、脯氨酸基因
• 3.7 LEA（late-embryogenesis abundant）蛋白基因
• 4 小油桐研究进展
• 4.1 形态特征和生物学特性
• 4.2 小油桐地理分布
• 4.3 小油桐资源利用现状
• 4.3.1 药用价值
• 4.3.2 生物柴油
• 4.3.3 生物农药
• 4.4 小油桐组织培养研究进展
• 4.4.1 小油桐无菌苗的萌发
• 4.4.2 组织培养再生
• 4.4.3 小油桐腋芽快速繁殖
• 4.4.4 小油桐胚乳组织培养研究
• 4.5 小油桐基因工程研究进展
• 5 结语
• 6 本论文研究的目的与意义
• 第二章 小油桐组织培养再生体系的建立
• 前言
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 材料的预处理
• 1.2.2 培养基
• 1.2.3 培养条件
• 1.2.4 培养过程
• 2 结果与分析
• 2.1 小油桐无菌苗的萌发
• 2.1.1 小油桐无菌苗萌发最佳消毒方式的确定
• 2.1.2 不同培养基对小油桐无菌苗萌发的影响
• 2.2 小油桐子叶愈伤组织和不定芽诱导最佳激素组合的筛选
• 2.2.1 小油桐子叶最佳激素配比浓度的筛选
• 2.2.2 不同培养基萌发的小油桐无菌苗子叶的分化差异
• 2.3 小油桐下胚轴愈伤组织和不定芽诱导最佳激素组合的筛选
• 2.4 小油桐真叶愈伤组织和不定芽诱导最佳激素组合的筛选
• 2.5 小油桐真叶柄愈伤组织和不定芽诱导最佳激素组合的筛选
• 2.6 小油桐增殖最佳激素组合的筛选
• 2.7 小油桐生根最佳激素组合的筛选
• 2.8 苗龄、培养基pH值、外植体放置方式对小油桐子叶诱导的影响
• 2.8.1 小油桐子叶愈伤组织和不定芽诱导最佳pH值的筛选
• 2.8.2 小油桐子叶愈伤组织和不定芽诱导最佳苗龄的确定
• 2.8.3 小油桐子叶愈伤组织和不定芽诱导最佳放置方式的确定
• 2.9 不同炼苗时间和移栽基质对小油桐移栽的影响
• 3 结论与讨论
• 3.1 材料的消毒与获得
• 3.2 外植体的选择对小油桐组织培养的影响
• 3.3 芽苗增殖
• 3.4 苗龄、培养基pH值、外植体放置方式对小油桐子叶组织培养的影响
• 3.5 生根培养
• 3.6 移栽
• 第三章 农杆菌介导ipt遗传转化小油桐研究
• 前言
• 1 小油桐遗传转化研究材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 农杆菌菌株及质粒
• 1.1.3 主要化学试剂
• 1.1.4 基本培养基
• 1.1.5 常用溶液配方
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 菌种的活化和预处理
• 1.2.2 小油桐无菌苗获得
• 1.2.3 遗传转化步骤
• 1.2.4 乙酰丁香酮（AS）的添加
• 1.2.5 卡那霉素（Kan）有效选择压的确定
• 1.2.6 抑菌剂浓度敏感性试验
• 1.2.7 抗性愈伤组织诱导检测和观察
• 1.2.8 遗传转化效率参数的优化
• 1.2.9 GUS组织化学染色
• 1.2.10 转基因植株的PCR检测
• 2 转ipt基因小油桐植株生理特性检测材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 材料预处理
• 2.2.2 叶绿素含量的测定
• 2.2.3 细胞膜过氧化物酶（POD）活性的测定
• 2.2.4 细胞膜保护物质含量的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 卡那霉素（Kan）有效筛选压的确定
• 3.1.1 卡那霉素（Kan）对小油桐子叶愈伤组织诱导和分化的影响
• 3.1.2 卡那霉素（Kan）对生根的影响
• 3.2 头孢霉素对子叶愈伤组织诱导和不定芽分化的影响
• 3.3 预培养时间对遗传转化的影响
• 3.4 农杆菌感染时间和菌液浓度对遗传转化的影响
• 3.5 共培养时间对遗传转化的影响
• 3.6 乙酰丁香酮对转化效率的影响
• 3.7 筛选培养时子叶不同放置方式对遗传转化的影响
• 3.8 转基因小油桐植株的GUS组织染色鉴定
• 3.9 转基因小油桐植株的分子生物学鉴定
• 3.10 ipt基因表达对小油桐的影响
• 3.10.1 小油桐高位分枝现象
• 3.10.2 小油桐叶片与叶柄连接处着生再生芽
• 3.11 低温处理对小油桐叶片叶绿素含量的影响
• 3.12 低温处理对小油桐过氧化物酶活性的影响
• 3.13 低温处理对小油桐叶片细胞膜保护物质含量的影响
• 3.13.1 低温处理对小油桐叶片可溶性糖含量的影响
• 3.13.2 低温处理对小油桐叶片可溶性蛋白含量的影响
• 4 结论
• 4.1 外植体的选择
• 4.2 影响转化频率的因素探讨
• 4.2.1 预培养对转化的影响
• 4.2.2 共培养对转化的影响
• 4.2.3 乙酰丁香酮的使用
• 4.3 浸染后对Kan抗性的增强
• 4.4 转ipt基因小油桐表型特征
• 4.4.1 转基因小油桐高位分枝
• 4.4.2 转基因小油桐叶片与叶柄连接处着生再生芽
• 4.5 ipt基因启动子调控
• 4.6 ipt基因表达对生理小油桐生理特性的影响
• 参考文献
• 缩写
• 致谢
• 附录