蜕皮甾酮的体外转运模型以及药物转运动力学研究

论文摘要

目的新药的非临床药代动力学研究是通过动物体内、外和人体外的研究方法,揭示药物在体内的动态变化规律,获得药物的基本药代动力学参数,阐明药物的吸收（Absorption）、分布（Distribution）、代谢（Metabolism）和排泄（Excretion）的动态变化规律。非临床药代动力学研究在新药研究开发的评价过程中起着重要作用。在药效学和毒理学评价中,药物或活性代谢物浓度数据及其相关药代动力学参数是产生、决定或阐明药效或毒性大小的基础,可提供药物对靶器官效应（药效或毒性）的依据;在药物制剂学研究中,非临床药代动力学研究结果是评价药物制剂特性和质量的重要依据;在临床研究中,非临床药代动力学研究结果能为设计和优化临床研究给药方案提供有关参考信息。近年来,通过肠上皮细胞的培养作为研究药物吸收、代谢机制的体外模型取得令人鼓舞的进展。最具代表性的细胞来自人类结肠癌细系的Caco-2（The human colon carcinoma cell line,Caco-2）细胞。Caco-2细胞单层模型可以在细胞水平提高关于药物分子通过小肠黏膜吸收、代谢、转运的信息,其结果与口服药物在体内小肠上皮细胞吸收过程有良好的相关性。另外,有研究表明用1α,25-二羟维生素D3（VD3）共培养2周后可诱导Caco-2细胞CYP3A4 mRNA的表达,更进一步的增加了与人类小肠环境的相似性,也同时采用,用以考察药物的转运动力学。本课题组过去的实验研究已证实蜕皮甾酮（Ecdysterone, EDS）对胰岛素抵抗具有调节作用,因此可能用于Ⅱ型糖尿病的治疗。本研究的目的是研究其在Caco-2细胞单层膜上转运吸收情况,为其药用剂型的研究打下基础。方法2种Caco-2细胞单层模型的建立、评价: Caco-2细胞单层模型Caco-2细胞用内含10%胎牛血清的DMEM培养基,在37°C、5%CO2、湿度为90%的环境中培养,当细胞融合后,用胰酶-EDTA液消化,将细胞按5.67×105cells/mL接种于Millicell?细胞培养池（0.4 Ml/孔）,培养池下腔加入培养基0.6mL。第一周隔天换液,一周以后每天用DMEM换液,培养21～25 d后,以细胞单层模型跨膜电阻（Transepithelial electrical resistance,TEER）、标志物的表观通透系数（The apparent permeability coefficients, Papp）和形态学三个指标评价该Caco-2细胞单层模型的完整性。VD3干预的Caco-2细胞单层模型Caco-2细胞用内含10%胎牛血清的DMEM培养基,在37°C、5%CO2、湿度为90%的环境中培养,当细胞融合后,用胰酶-EDTA液消化,将细胞按5.67×105cells/mL接种于Millicell?细胞培养池（0.4 Ml/孔）,培养池下腔加入培养基0.6mL。第一周隔天换液,一周以后每天便开始用加入了1α,25-二羟维生素D3的DMEM培养基换液。培养21～25 d后,以细胞单层模型跨膜电阻、标志物的表观通学二个指标评价2种Caco-2细胞单层模型的完整性。将药物溶液分别加在Caco-2细胞单层膜的基低侧（Basolateral,BL）或绒毛面侧（Apical,AP）,从2个方向考察药物的转运,在不同的时间从2个方向取样,用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）,测定药物在不同时间的浓度,采用外标法进行定量。色谱条件:色谱柱:C18柱,150×4.6mm,i.d,5μm;流动相:乙腈-水（20:80）;紫外检测波长:248nm;流速:1 mL/min;柱温:室温;进样量:20μl。在上述方法学的基础上,开展蜕皮甾酮的转运实验以及其转运动力学研究。结果2种Caco-2细胞经过21～25 d培养后,形态学观察可见细胞融合形成连续、完整的单层细胞层,细胞表明覆盖一层刷状缘微绒毛,此时Papp<1.0×10-6cm/s.TEER>200?×cm2。说明2种Caco-2细胞模型都具有良好的完整性,可用于药物吸收动力学研究。应用2种Caco-2细胞单层模型进行的蜕皮甾酮吸收动力学表明,在50～400μmol/L的浓度范围类Papp在0.8×10-6cm/s左右。2种Caco-2细胞模型检测的蜕皮甾酮的Papp没有明显变化。另外,加入P-糖蛋白抑制剂维拉帕米的的蜕皮甾酮药物吸收有增加但不显著。可能为P-糖蛋白的底物。结论本研究建立了2种Caco-2细胞模型。并进行了完整性评价,表明所建立的2种Caco-2细胞模型可用于药物转运研究。应用所建立的2种Caco-2细胞模型对蜕皮甾酮进行了药物吸收动力学研究。结果表明:在一般Caco-2细胞模型以及用VD3诱导改良的Caco-2细胞模型中,蜕皮甾酮主要表现为被动扩散为主,吸收情况1%～10%的药物。被动转运的渗透性没有受到CYP3A4-介导的机制的影响。另外,蜕皮甾酮还有可能是P-糖蛋白的底物。

论文目录

• 英汉缩略语名词对照
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正文 蜕皮甾酮的体外转运模型以及药物转运动力学研究
• 前言
• 一、Caco-2细胞单层模型及在口服药物吸收动力学研究中的应用
• 二、蜕皮甾酮的研究
• 三、本论文的思路和方法
• 第一部分 Caco-2 细胞单层模型的建立与评价
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第二部分 蜕皮甾酮的MTT 实验
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第三部分 蜕皮甾酮的转运实验以及其转运动力学研究
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 全文总结
• 参考文献
• 文献综述
• 致谢
• 硕士期间发表的论文