翼手目维生素C合成系统进化研究

论文摘要

维生素C是脊椎动物体一种不可或缺的营养成分,它能够保护机体免除氧化损伤,缺乏维生素C能够导致机体坏血病。大部分的动物能够以葡萄糖为原料经由一系列的酶催化反应合成自身所需的维生素C。在爬行动物和低等鸟类中,维生素C的合成是在肾脏中进行的；而在高等的鸟类和哺乳动物中,维生素C的合成发生在肝脏中。动物丧失维生素C合成能力的现象是很罕见的。灵长类的类人猿亚目,如人类和大猩猩,是不能够合成维生素C的,而较原始的原猴亚目,如懒猴和狐猴,仍然保留这种合成能力；豚鼠同样也不能合成维生素C,然而其它啮齿目动物如大鼠、小鼠等式能够正常合成的；另外鸟类中比较高等的雀形目也出现了维生素C合成能力丧失的现象。这些物种之所以不能合成维生素C,是因为它们的体内都缺乏一种负责维生素C合成最后一步的关键酶——古洛糖酸内酯氧化酶(GULO)。在人和豚鼠中,编码该酶的基因——GULO积累了很多有害突变,发生了假基因化。前人的研究表明,所有蝙蝠,无论是食虫的还是食果的,由于体内缺乏GULO,无法自身合成维生素C。这些文章的研究对象主要针对新大陆蝙蝠物种,并且缺乏相关基因信息的研究。因此我们设计了一系列的包括从分子克隆、蛋白质表达、酶活性鉴定以及GULO基因进化分析的实验来系统的研究蝙蝠该基因的丧失情况。研究对象包括旧大陆蝙蝠中的两种食果蝙蝠(棕果蝠和犬蝠)以及两种食虫蝙蝠(大蹄蝠和马铁菊头蝠)。结果确出乎我们的意料。我们克隆到了棕果蝠和大蹄蝠全长GULO编码基因,并且该基因在两个物种中都有正常的mRNA表达。另随后进行的蛋白质表达检测发现棕果蝠和大蹄蝠能够正常表达GULO蛋白,而犬蝠和马铁菊头蝠同样也有蛋白水平表达,但是表达量较弱。(GULO活性检测实验表明棕果蝠和大蹄蝠表达的GULO蛋白具有酶活性,而犬蝠和马铁菊头蝠却丧失了酶活性。基因进化分析显示,棕果蝠和大蹄蝠的GULO基因处于强烈的纯化选择,与其基因仍然保留功能相一致,而对于丧失GULO活性的马来大狐蝠,该基因却处于松弛选择的状态,符合其基因丧失功能的特性。接下来的大规模的蝙蝠GULO基因测序以及进化分析显示,该基因的功能丧失在蝙蝠中是以一种阶段性的加速进化方式进行的。蝙蝠的总体基因选择压力高于劳亚大陆祖先12至54倍之多。狐蝠属的基因选择压力最高,接近于中性进化,表明其基因丧失功能开始与较早的时间(可能在3百万年左右的祖先状态就已经开始了),其它蝙蝠的基因选择压力相对较低(纯化选择),表明其基因功能丧失是最近才发生的。综上所述,我们的研究结果推翻了50年来人们对于蝙蝠不能合成维生素C的错误认识,更重要的是,我们揭示了一种基因(GULO)及其功能丧失的过程,并在此基础上首次提出了一个新的概念——假基因的过程化,并且揭示了蝙蝠GULO基因的功能丧失模式——阶段性的加速进化。因此,我们的研究结果无论对于研究维生素C生物化学途径的科研工作者,还是对于研究假基因化的进化学家而言都具有重大意义。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 第一节 翼手目概述
• 第二节 脊椎动物维生素C合成能力研究进展
• 一. 维生素C
• 二. 维生素C合成能力进化研究进展
• 第三节 翼手目古洛糖酸内酯氧化酶研究进展
• 第二章 材料和方法
• 第一节 实验材料
• 第二节 实验方法
• 一. 蝙蝠GULO基因克隆
• 二. 兔抗蝙蝠GULO多克隆抗体的制备
• 三. 蝙蝠GULO蛋白质免疫印迹
• 四. 蝙蝠GULO活性分析
• 五. 进化分析
• 第三章 结果
• 第一节 蝙蝠GULO基因
• 第二节 兔抗蝙蝠GULO多克隆抗体
• 一. batGULO表达载体的构建
• 二. batGULO融合蛋白的表达及纯化
• 第三节 蝙蝠GULO蛋白质免疫印迹
• 第四节 蝙蝠GULO活性分析
• 第五节 蝙蝠GULO基因进化分析
• 第四章 翼手目GULO进化研究
• 第一节 蝙蝠GULO基因克隆
• 第二节 蝙蝠GULO基因进化分析
• 第三节 翼手目GULO基因功能丧失的意义
• 第五章 讨论
• 第一节 蝙蝠维生素C合成研究
• 第二节 维生素C合成能力的进化
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附录
• 附录一:发表文章
• 附录二:致谢