论文摘要
研究背景和目的肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC,下称肝癌）是世界范围内常见的恶性肿瘤之一,全球发病率超过62.5万／年,居恶性肿瘤的第5位,死亡率接近60万/年,位居肿瘤相关死亡的第3位。在我国,肝癌发病人数约占全球的55%,发病率居于恶性肿瘤的第3位,死亡率呈逐年增加趋势,在肿瘤相关死亡中位居第3,仅次于肺癌和胃癌。因此,肝癌严重威胁我国人民的健康和生命。早期肝癌治疗仍以外科手术切除或肝移植为最佳选择,晚期肝癌治疗方法包括肝动脉栓塞化疗、放射治疗、生物治疗及分子靶向治疗等。目前仍无标准的系统化疗方案应用于肝癌的治疗,研究认为肝癌细胞容易对化疗药物产生多药耐药是导致肝癌系统化疗疗效不佳的主要原因。因此,寻找一种可以增加肝癌细胞化疗敏感性的药物,并阐明其化疗增敏的作用机制,是肝癌治疗研究的重要内容。大蒜素（Allicin）为百合科葱属植物大蒜鳞茎中提取的有机硫化合物,主要化学成分为二烯丙基三硫化合物（Diallyl trisulfide,DATS）,是大蒜中主要的活性成分,具有抗菌、抗氧化、抗衰老、抗血小板凝集、降血糖、降血脂、降血压等多种作用,临床上常被用于抗微生物感染、心血管疾病的治疗及增强机体免疫力等方面。研究发现大蒜素可通过抑制DNA合成、调控细胞周期、诱导细胞凋亡等作用机制,抑制肿瘤增殖,包括结直肠癌、胃癌、乳腺癌等。今年研究表明,大蒜素可增加结直肠肿瘤细胞对伊立替康的敏感性,但其具体作用机制仍未明确。Nek2是细胞周期调控蛋白激酶（NIMA-related kinase,Nek）家族成员之一,该家族成员包含Nekl至Nekl1这11种激酶,这些激酶主要在调节细胞周期方面发挥活性。Nek2也参与细胞周期调控,表达具有细胞周期依赖性,G1期较低,G1/S期快速增加3-4倍并维持至G2期,进入M期便迅速下降。目前发现Nek2主要的生理功能包括组装中心体、调控中心体分离、促进染色质凝缩等。另外,Nek2在染色体的准确分离过程中也起到重要作用。由此可见,Nek2在维持基因组稳定性方面发挥重要功能。非整倍体及染色体不稳定是肿瘤最常见的两大特征,通常由细胞分裂或染色体分离异常引起。作为维持基因组稳定的重要分子,Nek2在多种肿瘤中高表达,包括卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、肾乳头状瘤、肝细胞癌等。在肝癌的研究中发现,Nek2等7个基因可以很好从转录水平反映正常肝-肝硬化-肝癌这一疾病进展过程。还有研究发现过表达Nek2后导致染色体不稳定,且Nek2与肿瘤进展、预后不良及化疗药物耐药密切相关,Nek2有可能成为肿瘤治疗中的重要调节分子。本研究在发现大蒜素增加肝癌细胞对氟尿嘧啶敏感性的基础上,对大蒜素化疗增敏作用机制进行了初步探讨,并通过基因过表达手段分析Nek2在这一过程中所起的调控作用,为临床上肝癌系统化疗治疗方案的选择提供理论依据。方法1.大蒜素增加肝癌细胞对氟尿嘧啶敏感性。通过MTT实验,Probit回归分析方法分别测定大蒜素、氟尿嘧啶对肝癌细胞株SK-Hep1、BEL-7402的半数抑制浓度（ICso）。根据IC50值选用适当的浓度梯度（大蒜素浓度为0、3、6、10μg/ml,氟尿嘧啶浓度为0、100、300μg/ml）,分别给予大蒜素和／或氟尿嘧啶处理肝癌细胞48h后,经MTT法测定并计算细胞存活率,并根据公式CI=（D）1/（Dx）1+（D）2/（Dx）2计算两种药物的相互作用方式。2.大蒜素协同氟尿嘧啶诱导肝癌细胞线粒体途径凋亡。实验分组如下：对照组、单药大蒜素组（3 μg/ml）、单药氟尿嘧啶组（100 μg/ml）、大蒜素联合氟尿嘧啶双药组。通过Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测药物处理48h后各组肝癌细胞的早期凋亡水平的变化,并通过Western blot检测全长及裂解活化形式的PARP、caspase-3及Bcl-2等凋亡相关蛋白表达水平的变化。利用JC-1荧光探针染色并通过流式细胞仪分析各组药物处理后细胞的线粒体膜电位改变；利用DCFH-DA荧光标记法通过流式细胞仪检测细胞内活性氧（ROS）生成量的变化。3.大蒜素联合氟尿嘧啶下调Nek2的表达,促进肝癌细胞凋亡。细胞根据分组给予药物处理48h后,通过Western blot检测Nek2蛋白水平的表达。进一步构建pEGFP-N1-Nek2质粒,并转染BEL-7402使Nek2过表达后,予以不同药物处理,用Western blot检测全长及裂解活化形式的PARP、 caspase-3等凋亡相关蛋白的表达水平的变化。结果1.大蒜素增加肝癌细胞对氟尿嘧啶敏感性。利用MTT法测定大蒜素对SK-Hepl.BEL-7402肝癌细胞株的IC50分别为10.389μg/ml、10.004μg/ml.氟尿嘧啶对SK-Hepl、BEL-7402肝癌细胞株的IC50分别为438.945μg/ml、410.336μg/ml。分别选取大蒜素浓度为0、3、6、10μg/ml,氟尿嘧啶浓度为0、100、300μg/ml,联合处理细胞48h后,经MTT法测定并计算细胞存活率,根据公式CI=（D）1/（DX）1+（D）2/（DX）2计算,CI值均小于1,证明大蒜素与氟尿嘧啶可协同作用于肝癌细胞,抑制细胞增殖。当选取大蒜素浓度为3μg/ml,氟尿嘧啶浓度100μg/ml时,采用one-way ANOVA统计方法比较对照组、单药大蒜素、单药氟尿嘧啶及双药处理组各组之间差异,两两比较选用LSD法,发现大蒜素联合氟尿嘧啶双药组与单药氟尿嘧啶组相比,能够明显抑制细胞增殖能力（SK-Hepl:P=0.005; BEL-7402:P<0.05）;双药联合处理组与单药大蒜素相比,亦可明显抑制细胞增殖（SK-Hepl:P<0.001; BEL-7402:P<0.001）。2.大蒜素协同氟尿嘧啶诱导肝癌细胞线粒体途径凋亡。对药物处理后各组细胞行Annexin V-FITC/PI双染色,经流式细胞仪检测细胞早期凋亡水平,结果提示,双药组细胞早期凋亡率（SK-Hepl: 8.067% ± 1.097%; BEL-7402: 13. 667%±5. 5003%）较单药氟尿嘧啶组（SK-Hepl: 6.700% ±0.6928%; BEL-7402: 8.100% ±3.8743%）、单药大蒜素组（SK-Hepl: 1.133% ± 0. 4041%; BEL-7402: 2. 867%±1.8475%）及对照组（SK-Hepl：0.533%±0.057%1BEL-7402:1.600%±0.2646%）明显增高,差异均具有统计学意义（P<0.05）。进一步通过JC-1荧光探针标记,流式细胞仪检测各组细胞线粒体膜电位改变情况,发现双药处理组线粒体膜电位降低的细胞百分比明显增加：对照组3.933% ±1.7214% （SK-Hep1）、9.300%±3.3719%（BEL-7402）;单药大蒜素组6. 400% ±4.2790% （SK-Hep1）、18.600%±5.806% （BEL-7402）;单药氟尿嘧啶组16.767% ±8.3680%（SK-Hep1）、28.233%±4.8211%（BEL-7402）;双药组36.467% ± 1.9858% （SK-Hep1）、46.800%±16.2923% （BEL-7402）。统计分析结果示差异显著（P<0.05）,提示大蒜素联合氟尿嘧啶通过线粒体途径诱导细胞凋亡增加。接着,通过DCFH-DA荧光标记法流式细胞术检测细胞内平均荧光强度反映细胞内活性氧（ROS）生成量,SK-Hep1细胞株对照组：573.67±39.627；单药大蒜素组：746±22.113；单药氟尿嘧啶组：794±24.062；双药组：3914.33±36.295。BEL-7402细胞株对照组：400.33±30.827；单药大蒜素组：736.33±13.051；单药氟尿嘧啶组：627.67±42.712；双药组：2042±61.262。由此可见,双药组细胞内活性氧（ROS）水平较单药组明显增高,经分析差异具有统计学意义（P<0.001）。3.大蒜素联合氟尿嘧啶下调Nek2的表达,促进肝癌细胞凋亡。利用Western blot检测各组处理后细胞的Nek2表达差异,发现双药处理组Nek2表达水平较单药处理组及对照组降低。通过构建pEGFP-Nl-Nek2质粒,并转染BEL-7402使Nek2过表达后,根据分组予以不同药物处理后,经Western blot检测活化形式的PARP、caspase-3蛋白水平表达,发现过表达Nek2后,双药处理组细胞凋亡水平较转染前减少,提示上调Nek2的表达,能够阻断大蒜素诱导的肝癌细胞对氟尿嘧啶的化疗增敏作用。结论1.大蒜素协同氟尿嘧啶抑制肝癌细胞增殖。2.大蒜素联合氟尿嘧啶促进细胞内ROS的产生,诱导细胞线粒体途径凋亡。3.大蒜素下调Nek2表达,增加肝癌细胞对氟尿嘧啶的敏感性。