微生物来源的蛋白酶体抑制剂的研究

论文摘要

泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway, UPP）在生物体内主要起到选择性降解蛋白质的重要作用,并且参与细胞转录、蛋白质稳定、DNA修复、细胞周期调控和应激反应等多种生理过程。蛋白酶体抑制剂具有抗肿瘤、抗真菌、免疫抑制等作用,经研究发现蛋白酶体还与风湿性疾病、糖尿病、白血病等疾病有着密切的关系,因此蛋白酶体是药物研发的一个重要靶点。为了研发更加有效和低毒的蛋白酶体抑制剂类药物的先导化合物,本研究利用自建的快速、高效的以蛋白酶体为靶点的高通量筛选模型,对4467株真菌和1200株放线菌的次级代谢产物进行了筛选,得到3株目的菌株。经过初步分类学鉴定,确定菌株F04W2166属于真菌轮枝孢霉属,F05B151属于真菌曲霉属,F05ZA896属于真菌毛壳菌属。本研究对3株目的菌株分别进行放大发酵,在活性指导下,对得到的发酵产物用多种分离纯化手段：溶剂萃取、中压硅胶层析、中压ODS柱层析、Sephadex LH-20层析、HPLC制备等分离纯化手段,对其发酵产物进行处理,最终得到9个化合物：F04W2166A、F04W2166B、F05ZA896A、F05B151A、B、C、D、E和F。通过对9个化合物的紫外、质谱和核磁等数据分析,确定F04W2166A和F04W2166B分别为已知化合物pullularin C和verticillin D。F05ZA896A结构与chetomin相同。F05B151A、B、C、D和F分别为9-hydroxymicroperfuranone、clavatol、3-（l-methylethyl）-3,4-dihydro-1H-1,4-benzodiazepine-2,5-dione、C1O-deoxy derivative of gerfelin和soyasaponin 1。F05B151C和F05B151E为新的天然产物,其中F05B151E是两个平面结构相同,但是立体结构不同的新化合物,暂定结构为（1 R,4R）-4-（（（9R,9aR）-1,9-dihydroxy-2,2-dimethyl-3-oxo-2,3,9,9a-tetrahydro-1H-imidazo[1,2-a]indol-9-yl）methyl）-1-isopropyl-[1,4]oxazino[3,4-b]quinazoline-3,6（1 H,4 H）-dione和（1 R,4S）-4-（（（9S,9aR）-1,9-dihydroxy-2,2-dimethyl-3-oxo-2,3,9,9a-tetrahydro-1H-imidazo[1,2-a]indol-9-yl）methyl）-1-isopropyl-[1,4]oxazino[3,4-b]quinazoline-3,6（1H,4H）-dione。在蛋白酶体的体外抑制试验中,F04W2166A、F04W2166B、F05ZA896A、F05B151A、F05B151B、F05B151E对蛋白酶体显示较强的抑制活性,IC50值分别为3.1、1.5、0.1、2.5、20和10μg/mL,F05B151C和F05B151D的抑制率较弱,IC50值为120和150μg/mL而化合物F05B151F对蛋白酶体并没有表现出抑制活性。由于蛋白酶体是抗肿瘤的药物靶点,本研究进一步评价了对蛋白酶体具有较强抑制活性的6个单体化合物对人结肠癌细胞株HT-29和乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖的抑制活性。结果显示F04W2166A、F04W2166B、F05ZA896A三个化合物对肿瘤细胞显示较强的抑制活性,且抑制率呈浓度依赖关系,而F05B151A、B和E对肿瘤细胞没有明显的抑制活性。本研究从微生物次级代谢产物中分离得到3个新天然产物[F05B151C、F05B151E（1）和F05B151E（2）],其中[F05B151E（1）和F05B151E（2）]是2个新化合物。发现了5个对蛋白酶体具有较强抑制活性的化合物（F04W2166A、F04W2166B、F05ZA896A、F05B151A、F05B151B、F05B151E）,这些化合物及其活性的研究为以后研发蛋白酶体抑制剂类药物奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 文献综述
• 1.1 蛋白酶体
• 1.2 蛋白酶体的功能
• 1.3 蛋白酶体抑制剂的研究进展
• 1.3.1 肽醛类
• 1.3.2 硼酸肽类
• 1.3.3 β-内酯类
• 1.3.4 环肽类
• 1.3.5 环氧酮
• 1.3.6 乙烯基砜类
• 1.3.7 其他
• 2 实验部分
• 2.1 仪器
• 2.2 药品及试剂
• 2.3 筛选用微生物菌株
• 2.3.1 真菌
• 2.3.2 放线菌
• 2.4 筛选样品的制备
• 2.5 蛋白酶体抑制剂的筛选
• 2.5.1 蛋白酶体抑制剂活性测定方法
• 2.5.2 目的菌株的确定
• 2.6 阳性菌株的分类学鉴定
• 2.7 目的菌株的发酵培养
• 2.7.1 真菌F04W2166、F05Z896的培养
• 2.7.2 真菌F05B151的培养
• 2.8 阳性菌株发酵产物的提取和分离
• 2.8.1 F05B151发酵产物的提取和分离
• 2.8.2 F04W2166发酵产物的提取和分离
• 2.8.3 F05ZA896发酵产物的提取和分离
• 2.9 目的化合物结构测定
• 2.10 目的化合物活性测定
• 2.10.1 蛋白酶体体外抑制活性的测定
• 2.10.2 对体外培养癌细胞增殖的抑制作用
• 3 实验结果
• 3.1 样品筛选结果
• 3.2 活性菌株的菌种鉴定结果
• 3.2.1 F04W2166的鉴定结果
• 3.2.2 F05ZA896的鉴定结果
• 3.2.3 F05B151的鉴定结果
• 3.3 化合物的理化性质及结构
• 3.3.1 F04W2166A
• 3.3.2 F04W2166B
• 3.3.3 F05ZA896A
• 3.3.4 F058151A
• 3.3.5 F05B151B
• 3.3.6 F05B151C
• 3.3.7 F05B151D
• 3.3.8 F05B151 E（1）和F05B151E（2）
• 3.3.9 F05B151F
• 3.4 化合物活性测定结果
• 3.4.1 化合物对蛋白酶体的体外抑制活性
• 3.4.2 化合物对肿瘤细胞的抗增殖作用
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 后记（含致谢）
• 攻读学位期间取得的科研成果清单