论文摘要
原发性肝癌在所有恶性肿瘤中发病率居第五,病死率居第三,其中包括肝细胞肝癌（hepatocellμlar carcinoma, HCC）和肝内胆管细胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma, ICC）。虽然近年来肝癌的临床诊治取得了长足进步,但是由于其高复发率和高转移率,肝癌患者的长期生存仍令人不满意。当前,转移复发已成为进一步提高肝癌疗效的瓶颈和关键。临床上迫切需要探索和阐明肝癌转移复发的分子机制、准确预测患者预后、寻找高效的靶点并设计合理干预治疗的新方法。传统的肝癌研究注重肿瘤细胞自身,试图从癌细胞本身基因与表型改变来解释肿瘤的复发转移。新近的研究越来越关注作为与肿瘤密不可分的局部微环境对肿瘤演进所起的重要作用。炎症免疫环境作为肿瘤微环境的重要组成,与肿瘤的发生发展、复发转移都有着密切的关系。由乙型／丙型肝炎病毒感染,或其他非病毒因素如酒精或肥胖等,导致的肝脏慢性炎症及继发的肝硬化状态是HCC发生发展的“土壤”。而对于ICC而言,目前众多研究亦表明其是一种与炎症密切相关的恶性肿瘤,炎症以及相应的免疫应答在其发生和进展中扮演着重要的角色。TH17细胞是一类与炎症及自身免疫性疾病相关的辅助T细胞。最近研究发现TH17细胞和它的主要功能性因子IL-17在一些肿瘤中明显升高,但是TH17细胞与肿瘤免疫之间的关系尚无定论。IL-17对肿瘤的好坏往往取决于肿瘤微环境状态。裸鼠体内实验发现,转染IL-17后肿瘤细胞生长显著加快；相反,在有免疫力的鼠体内,IL-17却能够抑制肿瘤生长。临床研究也发现,在前列腺癌、卵巢癌中TH17细胞亦有利于抑肿瘤。另外,最近报道,环磷酰胺可通过降低Treg细胞、升高TH17和TH1细胞以发挥抗肿瘤作用。但是,在肝癌中却发现肿瘤微环境中升高的TH17/IL17与患者的不良预后明显相关。可见,TH17细胞在肿瘤免疫中发挥的作用取决于机体的免疫背景、肿瘤类型及组织器官微环境等诸多因素。目前,关于TH17细胞及相关细胞因子在原发性肝癌发生发展过程中作用的研究处于起步阶段,相关机制尚远未阐明。本研究通过体内外实验,系统性地分析外源性IL-17对肝细胞肝癌的生长和侵袭转移的影响及相关分子机制。并进一步通过组织微列阵技术,对HCC和ICC微环境中以IL-17+细胞为主的炎症／免疫活性细胞的类型、数目、分布、功能状态及相关临床意义等进行细致深入的评估。第一部分IL-17对人肝细胞肝癌生长增殖及侵袭的影响目的：观察IL-17对人肝癌细胞株Huh7、SMMC7721生长增殖及侵袭的影响。方法：细胞免疫荧光检测IL-17的受体IL-17R在Huh7、SMMC7721细胞株的定位及表达情况。荧光定量PCR检测IL-17R在mRNA水平的表达量。MTT法检测IL-17在不同药物浓度（0,0.1,0.5,1,5,10,50,100 or 500 ng/m1）和不同作用时间（1-4 d）对Huh7、SMMC7721生长增殖的影响。细胞划痕和transwell实验观察IL-17（50 ng/m1）对Huh7、SMMC7721侵袭迁移能力的影响。结果：Huh7、SMMC7721肝癌细胞均存在IL-17R的表达。不同作用时间、不同浓度的IL-17对Huh7、SMMC7721细胞的相对增殖率无明显影响（p>0.05）。细胞划痕实验提示IL-17干预组的肝癌细胞较对照组的迁移能力明显增强。Transwell实验结果提示IL-17干预组的肝癌细胞较对照组的侵袭能力明显增强（p<0.05）。结论：IL-17对HCC细胞生长增殖无明显促进作用,但可直接通过其受体IL-17RA促进肿瘤侵袭和迁移。第二部分IL-17促进肝细胞肝癌侵袭、演进的机制研究目的：探讨IL-17促HCC侵袭、演进的相关机制。方法：应用ELISA法和Western blot方法分别检测外源性IL-17作用于Huh7、SMMC7721肝癌细胞株后相关炎症因子和信号通路的变化情况。并进一步采用小干扰RNA （siRNA）技术干扰STAT3和AKT,以及加入外源性IL-6、IL-6mAb等,研究IL-17对相关阳性炎症因子和信号转导通路的影响。Transwell观察在不同作用条件下肝癌细胞侵袭能力的变化。构建IL-17稳定转染的SMMC7721细胞,种于裸鼠皮下,观测IL-17过表达对肿瘤细胞生长侵袭的影响以及相关炎症因子、信号通路的变化情况。免疫组化染色31例人HCC临床标本,分析验证相关结果。结果：IL-17作用于Huh7及SMMC7721细胞后,IL-6、IL-8、MMP2和VEGF较对照组明显升高（p<0.05）,而IL-1β、TNF-α、TGF-β、G-CSF、GM-CSF、IFN-γ和IL-12p70变化不明显（p>0.05）。IL-17明显上调p-JAK2、P-STAT3、p-AKT,而对p-p65 NF-KB、p-JNK、p-ERK1/2、p-p38 MAPK表达无明显影响。AKT干扰可抑制IL-17对STAT3的活化,但STAT3干扰对AKT活化却无明显影响。STAT3和AKT干扰均可明显抑制IL-17对IL-8、MMP2、VEGF表达的上调（p<0.001）,但IL-6表达上调仅在AKT干扰时被抑制。IL-6 mAb可下调P-STAT3以及IL-8、MMP2、VEGF的表达,但对AKT活化无明显影响。外源性加入IL-6可逆转AKT干扰对IL-8、MMP2、VEGF以及P-STAT3表达的下调。裸鼠体内实验显示IL-17明显促进肿瘤生长、血管形成和中性粒细胞浸润。SMMC7721-17组外周血中的IL-6、IL-8、MMP2、VEGF也明显较SMMC7721-mock组升高（p<0.01）,SMMC7721-17组肿瘤组织中P-STAT3、p-AKT、MMP2明显高表达。通过31例临床肝癌标本显示,肿瘤内IL-17+细胞密度与微血管密度（r=0.536,p=0.002）和中性粒细胞密度（r=0.671,p<0.001）均明显相关。同时,P-STAT3表达强度与肿瘤内IL-17+细胞密度、微血管密度及中性粒细胞密度也呈显著正相关（分别为：r=0.365,p=0.043；r=0.478,p=0.007；r。0.519,p=0.003）。结论：IL-17通过活化AKT来上调IL-6的表达,IL-6进一步活化STAT3及STAT3下游的IL-8、MMP2、VEGF,进而促进肿瘤侵袭演进、血管形成、中性粒细胞浸润。第三部分IL-17联合P-STAT3预测肝细胞肝癌预后的价值目的：探讨IL-17和P-STAT3的表达与肝癌患者临床病例特征之间的关系及预测术后复发转移的价值。方法：组织芯片和免疫组化检测323例接受根治性切除手术患者肝癌组织中IL-17与P-STAT3的表达,根据两者表达水平将患者分别分为两组、或者联合后分为三组,分析两者与肝癌临床病理特征及预后的关系。结果：IL-17和p-STAT3均在肿瘤血管侵犯病例中高表达（p=0.016,p=0.013）,两者呈显著正相关（r=0.315,p<0.001）。生存曲线分析显示,单独IL-17high的术后总生存率明显较IL-17low为低（p=0.001）,术后复发率明显升高（p=0.016）。单独p-STAT3high的术后总生存率明显较p-STAT3low为低（p<0.001）,而术后复发率明显升高（p=0.010）。联合组groupI（IL-17high/ p-STAT3high组）的术后总生存率显著低于group II （IL-17high/p-STAT3low或IL-17low/p-STAT3high组）和group III （IL-17low/p-STAT3low组）（p=0.001和p< 0.001）。Group I的术后复发率显著高于group II和group III （p=0.047,p=0.001）。单独的IL-17、p-STAT3以及两者的联合均是影响术生存和复发的独立预后因素,但联合IL-17与p-STAT3对生存和复发的预测价值高于单个指标。当IL-17、p-STAT3以及两者的联合纳入同一模型进行多因素分析时,仅两者的联合对预测生存和复发有意义（p<0.001和p=0.009）。联合组中group I与group IIII相比总生存的风险系数为2.244（95% CI,1.529-3.293,p<0.001）,复发的风险系数为1.718（95%CI,1.193-2.473,p=0.004）。结论：IL-17和p-STAT3均是肝癌术后生存复发的独立预后因素,但IL-17联合p-STAT3是一个更好的独立预后指标,更能准确预测术后的生存与复发。第四部分IL-17与肝内胆管细胞癌预后的相关性研究目的：探讨肝内胆管细胞癌组织中的IL-17阳性（IL-17+）细胞及相关炎症、免疫细胞与预后的关系。方法：应用组织芯片及免疫组化检测123例接受根治性切除手术患者的肝内胆管细胞癌组织中IL-17+细胞、FOXP3阳性（FOXP3+）细胞、CD8阳性（CD8+）细胞、中性粒细胞（CD66b+）和微血管（CD34+）的分布、密度,并分析其相互间的关联性及与患者预后之间的关系。结果：IL-17+细胞,FOXP3+细胞和CD66b+中性粒细胞主要聚集在癌内区域,显著高于癌旁（p<0.0001）；而CD8+淋巴细胞大量聚集在癌-癌旁交界处,显著高于癌和癌旁组织（p<0.0001）。单因素分析显示,肿瘤中IL-17+细胞的密度越高（p=0.00019）或者中性粒细胞的密度越高（p=0.00024）患者愈后显著越差,两者联合分析则效果更显著（p<0.0001）。多因素分析显示IL-17+细胞,中性粒细胞以及两者联合（HR=2.80；95% CI,1.72-4.57；p<0.0001）均为独立的预后因素。ROC曲线分析显示联合癌内IL-17+细胞和中性粒细胞比常规的临床病理特性（如肿瘤大小、肝内播散和淋巴结转移等）更能准确预测预后（AUC=0.735；95% CI,0.617-0.854；p=0.002）。肿瘤组织中的IL-17+细胞密度与淋巴结转移、肝内播散和进展期肿瘤明显相关,中性粒细胞则仅与血管侵袭相关。此外,瘤内IL-17+细胞与中性粒细胞密度及微血管密度存在明显的正相关（r=0.238,p=0.008；r=0.440,p<0.0001）。结论：肿瘤组织中的炎症、免疫状态对于肝内胆管细胞癌患者的预后具有重要的临床意义。肝内胆管细胞癌中IL-17+细胞及与其显著正相关的中性粒细胞密度越高预后越差,两者是术后独立的预后因素。
论文目录
相关论文文献
标签：肝细胞肝癌论文; 肝内胆管细胞癌论文; 侵袭转移论文; 肿瘤微环境论文; 肿瘤免疫论文; 中性粒细胞论文; 预后论文;