胸腺素β4表皮特异性表达载体的构建及转基因小鼠的研究

论文摘要

胸腺素β4（Thymosin beta4, Tβ4）是肌动蛋白结合肽家族的一员,具有促进毛囊发育,加快毛发生长的作用。为了深入了解Tβ4基因对毛囊发育与毛发生长的作用,本研究构建了表皮特异性表达载体,并通过转染阿尔巴斯绒山羊耳尖皮肤成纤维细胞,验证启动子的表达能力。通过原核注射技术,制作转Tβ4基因小鼠,得到PCR阳性小鼠,并检测阳性小鼠尾尖Tβ4基因mRNA水平的表达量。1.表皮特异性表达载体pODsRed-KTP和pCDsRed-KTP的构建本研究构建了2个表皮特异性表达载体：pODsRed-KTP和pCDsRed-KTP。 pODsRed-KTP以角蛋白14启动子（keratin14promoter,pKRT14）指导Tβ4基因的表达,并以Oct-4启动子（Oct-4promoter,pOct-4）指导红色荧光蛋白的表达。作为对照载体,pCDsRed-KTP以pKRT14指导Tβ4基因的表达,以CMV启动子（CMV promoter, pCMV）指导红色荧光蛋白的表达。pKRT14是表皮特异性启动子,指导Tβ4基因在表皮类细胞中过表达,使得pODsRed-KTP与pCDsRed-KTP具有表皮特异性。pODsRed-KTP与pCDsRed-KTP区别在于pODsRed-KTP的红色荧光蛋白只在部分干细胞中表达,可以对干细胞进行示踪,而pCDsRed-KTP的红色荧光蛋白在大量细胞系中均表达,主要在后续试验中为pODsRed-KTP做对照。2.转染阿尔巴斯绒山羊耳尖皮肤成纤维细胞验证pKRT14功能将表皮特异性表达载体pODsRed-KTP和pCDsRed-KTP转入阿尔巴斯绒山羊耳尖皮肤成纤维细胞。以表达红色荧光蛋白的转pCDsRed-KTP细胞为对照,推测pODsRed-KTP的瞬时转染效率,约为31%。筛选稳定过表达Tβ4基因的细胞,检测Tβ4基因在mRNA水平的表达情况,与未转基因细胞相比,表达量上调了4.51倍。结果表明,pKRT14是有效的,能够启动Tβ4基因的表达。3.转Tβ4基因小鼠的制备与鉴定通过原核注射技术得到50只待检测幼鼠,经过PCR鉴定得到4只阳性小鼠,包括1只公鼠和3只母鼠,阳性小鼠得率为8%。检测Tβ4基因在阳性小鼠尾尖mRNA水平的表达量,与正常小鼠比较,阳性小鼠的mRNA水平的表达量介于1.32-2.05倍之间。本研究制作并初步鉴定了转Tβ4基因小鼠,为进一步研究Tβ4基因的功能,探索其作用机制等相关研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 缩略词表
• 第一部分 实验研究
• 第一章 表皮特异性表达载体的构建
• 摘要
• 1.实验材料
• 1.1 主要仪器设备
• 1.2 实验试剂与耗材
• 1.3 菌种和质粒
• 2.方法
• 2.1 pKRT 14的克隆以及pMD19T-pKRT 14克隆载体的构建
• 2.2 Tβ4基因的克隆以及pMD19T-Tβ4克隆载体的构建
• 2.3 PolyA的克隆以及pMD19T-PolyA克隆载体的构建
• 2.4 pOct-4的克隆以及pMD19T-Oct-4克隆载体的构建
• 2.5 中间载体pMD19T-KTP的构建与鉴定
• 2.6 中间载体pODsRed的构建与鉴定
• 2.7 表皮特异性表达载体pODsRed-KTP和pCDsRed-KTP构建
• 2.8 表皮特异性表达载体pODsRed-KTP与pCDsRed-KTP的线性化
• 3.结果
• 3.1 PCR产物的序列分析
• 3.2 表皮特异性表达载体pODsRed-KTP和pCDsRed-KTP的线性化
• 4.讨论
• 5.结论
• 参考文献
• 第二章 阿尔巴斯绒山羊耳尖皮肤成纤维细胞的转染与pKRT 14功能的验证
• 摘要
• 1.材料
• 1.1 仪器设备
• 1.2 主要试剂耗材
• 1.3 细胞来源
• 2.方法
• 2.1 阿尔巴斯白绒山羊耳尖皮肤成纤维细胞的解冻复苏与培养
• 2.2 阿尔巴斯白绒山羊耳尖皮肤成纤维细胞的传代与冻存
• 2.3 阿尔巴斯绒山羊细胞的转染与筛选
• 2.4 Tβ4基因mRNA表达水平检测
• 3.结果
• 3.1 细胞转染结果
• 3.2 实时荧光定量PCR结果
• 4.讨论
• 5.结论
• 参考文献
• 第三章 转基因β4基因小鼠的制作与鉴定
• 摘要
• 1.材料与仪器
• 1.1 仪器设备
• 1.2 材料与试剂
• 1.3 试验试剂
• 1.4 试验动物
• 2.方法
• 2.1 受精卵的采集
• 2.2 结扎公鼠的的制备与假孕母鼠的获得
• 2.3 原核注射
• 2.4 受体母鼠的子宫移植
• 2.5 转Tβ4基因首建鼠的PCR鉴定
• 2.6 Tβ4基因mRNA水平过表达量的检测
• 3.结果
• 3.1 转Tβ4基因小鼠的获得
• 3.2 转Tβ4基因小鼠的PCR鉴定结果
• 3.3 Tβ4基因mRNA水平过表达量的检测
• 4.讨论
• 5.结论
• 参考文献
• 第二部分 文献综述
• 一、毛囊的结构及功能
• 二、毛囊发育的分子基础
• 三、毛囊实验研究模型
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表旳论文