HPV16L1蛋白的分子生物学研究

论文摘要

【研究背景】人乳头瘤病毒（humanpapillomavirus,HPV） L1蛋白（major capsid protein）在HPV感染及其生活周期（life cycle）的各个阶段,特别是在病毒感染早期和诱发保护性体液免疫方面发挥重要作用。L1蛋白通过其羧基端的核定位信号（nuclear localization signal,NLS）先后二次进入宿主细胞核内,360分子的L1蛋白和12分子的L2蛋白通过二硫键组成的衣壳（capsid）包裹病毒DNA形成二十面体病毒毒粒（virion）;散布于HPV衣壳表面的L1蛋白线性表位（linealepitopes）和构象表位（conformational epitopes）是诱发机体保护性免疫反应的主要抗原表位（antigen epitopes）。本论文主要针对L1蛋白的生物学特性进行初步研究,以期为阐明L1蛋白在HPV感染机制及其生活周期中的作用,研制HPV预防性疫苗提供理论依据和实验方法。【研究目的】（1）利用生物信息学技术预测所有型别HPVs L1蛋白NLSs并予以分类,为HPV L1蛋白NLS及其核浆转运机制的研究提供指导。（2）研究HPV16 L1蛋白在Sf-9细胞中入核转运动力学过程,探讨NLSHPV16L1（HPV16 L1 protein NLS）被用于靶向药物载体的可能性。（3）研究不同亚细胞定位的表达产物对基因免疫诱导的机体体液免疫反应的影响。（4）制备抗HPV16特异性L1IgY抗体（egg yolk immunoglobulin,IgY）,为抗HPV16 L1蛋白抗体的制备和HPV16 L1蛋白的免疫检测探索新的方法。（5）用噬菌体随机肽库技术（phage display random peptide library）筛选、分析HPV16 L1蛋白的抗原表位,为HPV16预防性疫苗的研制提供参考。【研究方法】（1）从http://www.stdgen.lanl.gov/stdgen/virus , http://ca.expasy.org ,http://cubic.bioc.columbia.edu/predictNLS/和http://www.ncbi.nlm.nih.gov等数据库获取所有型HPVs L1蛋白氨基酸序列,利用PredictNLS软件对其进行NLS预测,根据经典NLS的一般规律及HPVs L1蛋白NLSs的同源性和结构特点予以分类。（2）分别构建并经同源重组获得重组Ac-EGFP、Ac-EGFP-HPV16L1、Ac-EGFP-HPV16L1△NLS、Ac-EGFP-NLSHPV16L1杆状病毒后,分别用其感染Sf-9昆虫细胞进行融合蛋白的表达,利用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescenceprotein,EGFP）标记的不同融合蛋白在Sf-9细胞内转运的动力学过程,分析NLSHPV16L1的核定位功能。（3）构建重组pcDNA-EGFP-HPV16L1和pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS真核表达载体,以基因免疫的方式免疫BALB/c小鼠,检测血清抗EGFP特异性IgG抗体水平。（4）利用由昆虫杆状病毒表达系统表达并经非变性法纯化的HPV16 L1蛋白免疫母鸡,制备抗HPV16 L1 IgY抗体。水稀释法纯化、ELISA法（Enzyme-linkedimmunosorbent assay）检测IgY抗体效价、免疫组织化学法（immunohistochemistry,IHC）和小鼠红细胞凝集抑制试验（hemagglutination inhibition assay,HAI）测定IgY抗体的活性。（5）用抗HPV16 L1多克隆抗体筛选噬菌体随机肽库,获得阳性噬菌体克隆,并经免疫斑点法（immunity blot test）检测其与抗HPV16 L1多克隆抗体的免疫结合能力,经基因测序和同源性分析,确定HPV16 L1抗原表位。【结果】（1）根据经典NLS的一般规律和HPVs L1蛋白NLSs的特征和组成,107型HPVs L1蛋白NLSs可分为15类,其中某些型别HPVs的L1蛋白含有与经典NLS不同的新的潜在NLS。（2）分别用构建的重组Ac-EGFP-HPV16L1、Ac-EGFP-HPV16L1△NLS、Ac-EGFP、Ac-EGFP-NLSHPV16L1杆状病毒感染Sf-9细胞,进行融合蛋白的表达,发现EGFP均匀分布于Sf-9细胞内;包含NLSHPV16L1的EGFP-HPV16L1和EGFP-NLSHPV16L1融合蛋白主要积聚于Sf-9细胞核内;删除NLSHPV16L1的EGFP-HPV16L1△NLS融合蛋白滞留于Sf-9细胞浆内。此外,还获得了EGFP和EGFP-HPV16L1、EGFP-HPV16L1△NLS融合蛋白。（3）重组pcDNA-EGFP-HPV16L1△NLS真核表达载体免疫组小鼠血清抗EGFP IgG抗体效价显著高于重组pcDNA-EGFP-HPV16L1真核表达载体免疫组小鼠血清抗EGFP IgG抗体效价（P<0.001）。（4）用HPV16 L1蛋白免疫母鸡制备的抗HPV16 L1IgY抗体可特异性与表达于CHO细胞内的EGFP-HPV16L1蛋白结合,并能抑制HPV16 L1病毒样颗粒（virus- like partical,VLP）介导的小鼠红细胞凝集（hemagglutination,HA）。（5）用抗HPV16 L1多克隆抗体筛选噬菌体随机肽库并经同源性分析获得的5条多肽“TNLDLYG”、“IFDNHP”、“LTFKPQ”、“GIDS”、“NHGLLYSPLPT”可与抗HPV16 L1多克隆抗体发生免疫结合反应。【结论】（1） 107型HPVs L1蛋白NLSs可分为15类,其中某些型别HPVs L1蛋白中具有与经典NLS不同的新的潜在NLS。这对于HPVs蛋白NLS和HPV L1蛋白核浆转运机制的研究具有一定的指导意义。（2） pFB-EGFP昆虫杆状病毒转移载体的构建和EGFP的获得,为获取EGFP标记的融合蛋白、实现蛋白功能和相互作用的可视化研究提供了技术储备。（3） HPV16 L1蛋白NLS具有核定位功能,有可能作为靶向药物载体。（4） Sf-9细胞表达的EGFP-HPV16L1和EGFP-HPV16L1△NLS是双功能融合蛋白,该双功能融合蛋白的制备为HPV16感染机制和L1蛋白生物学行为的可视化研究提供了可能。（5）在HPV16 L1蛋白氨基端融合较长基因或删除其羧基端的NLS均不影响VLP的形成。（6）表达于细胞浆内的蛋白较细胞核内蛋白能诱发更高的经基因免疫途径介导的机体体液免疫应答水平。（7）抗HPV16 L1 IgY抗体的制备，为大量制备抗HPV16 L1蛋白抗体和HPV16 L1蛋白的免疫检测提供了新的方法。（8）“TNLDLYG”、“IFDNHP”、“LTFKPQ”、“GIDS”、“NHGLLYSPLPT”多肽可能与HPV16 L1蛋白构象表位有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 前言
• 第二章 文献回顾
• 2.1 HPV 分类
• 2.2 HPV 基因组结构和编码产物
• 2.2.1 HPV 基因组LCR 结构
• 2.2.2 HPV 基因早期区
• 2.2.3 HPV 基因晚期区
• 2.2.4 HPV 基因产物及其功能
• 2.3 HPV 结构
• 2.4 HPV 传播方式
• 2.4.1 性接触传播
• 2.4.2 非性途径传播
• 2.4.3 HPV 在细胞之间的传播
• 2.5 HPV 受体及其吸附
• 2.6 HPV 的内化
• 2.6.1 宿主细胞的内吞机制
• 2.6.2 HPV 的内吞机制
• 2.7 细胞内转运
• 2.8 HPV 的脱颗粒
• 2.9 病毒基因组及衣壳的入核机制
• 2.10 HPV DNA 存在方式
• 2.10.1 HPVDNA 染色体外游离形式
• 2.10.2 HPVDNA 的整合
• 2.11 HPV 的共感染
• 2.12 HPV 致病性
• 2.13 HPV 转录、复制的调节
• 2.14 HPV 的复制和转录
• 2.15 HPV 衣壳蛋白的入核过程（参见2.9 相关内容）
• 2.15.1 L2 衣壳蛋白的入核过程
• 2.15.2 L1 衣壳蛋白的入核过程
• 2.16 HPV 衣壳的装配和成熟（参见2.3 相关内容）
• 2.17 HPV 的释放
• 2.18 HPV 免疫逃逸
• 2.19 HPV 感染的清除
• 2.20 HPV 感染的相关因素
• 2.21 结语
• 第三章 HPV L1 NLS 的生物信息学分析
• 3.1 数据来源和使用软件、程序
• 3.1.1 数据 来 源
• 3.1.2 使用软件、程序
• 3.2 方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 第四章 HPV16L1 蛋白入核的动力学观察
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 质粒、菌株和细胞
• 4.1.2 主要试剂
• 4.1.3 主要溶液、缓冲液和培养液
• 4.1.4 主要仪器和设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 PCR 引物设计
• 4.2.2 四种重组PFASTBAC-HTB 转移载体的构建
• 4.2.2.1 重组pFB-EGFP 转移载体的构建
• 4.2.2.2 重组pFB-EGFP-HPV16L1 转移载体的构建
• 4.2.2.3 重组pFB-EGFP-HPV16L1△nls 转移载体的构建
• 4.2.2.4 重组pFB-EGFP-NLSHPV16L1 转移载体的构建
• 4.2.3 重组BACMID DNA 的制备
• 4.2.3.1 重组杆状病毒辅助表达载体的转座反应
• 4.2.3.2 重组Bacmid DNA 的提取和鉴定
• 4.2.4 重组BACMID DNA 转染SF-9 细胞
• 4.2.4.1 Sf-9 细胞的培养
• 4.2.4.2 转染 Sf-9 细胞
• 4.2.4.3 重组杆状病毒的收获
• 4.2.4.4 重组杆状病毒的接种方法
• 4.2.5 HPV16 L1 NLS 入核动力学观察
• 4.2.5.1 倒置荧光显微镜观察
• 4.2.5.2 激光共聚焦显微镜观察
• 4.2.5.3 免疫组化检测EGFP 标记融合蛋白的表达
• 4.2.6 电子显微镜观察EGFP 标记的HPV16VLP 的形成
• 4.2.7 非变性条件下纯化EGFP 标记的融合蛋白（方法见PROBONDTM 操作方法）
• 4.2.7.1 ProBondTM Column 的准备
• 4.2.7.2 感染重组杆状病毒的Sf-9 细胞裂解液的制备
• 4.2.7.3 蛋白纯化
• 4.2.8. EGFP 融合蛋白的检测
• 4.2.8.1 Western blot 检测EGFP-HPV16L1 和EGFP-HPV16L1△NLS 融合蛋白
• 4.2.8.2 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测EGFP
• 4.2.9 小鼠红细胞凝集与凝集抑制试验
• 4.2.9.1 制备小鼠红细胞悬液
• 4.2.9.2 小鼠红细胞凝集试验
• 4.2.9.3 小鼠红细胞凝集抑制试验
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 四种重组PFASTBAC-HTB 转移载体的构建
• 4.3.1.1 重组pFB-EGFP 转移载体的构建
• 4.3.1.2 重组pFB-EGFP-HPV16L1 转移载体的构建
• 4.3.1.3 重组pFB-EGFP-HPV16L1△nls 转移载体的构建
• 4.3.1.4 重组pFB-EGFP-NLSHPV16L1 转移载体的鉴定
• 4.3.2 重组BACMID DNA 的鉴定
• 4.3.3 重组杆状病毒转染后SF-9 细胞的细胞病理学改变
• 4.3.4 HPV16 L1 NLS 入核动力学观察
• 4.3.4.1 HPV16 L1 NLS 介导的EGFP 在SF-9 细胞内的转运的动力学过程
• 4.3.4.2 激光共聚焦显微镜观察EGFP 融合蛋白的亚细胞定位
• 4.3.4.3 免疫组化检测EGFP 标记融合蛋白的表达
• 4.3.5 电子显微镜观察EGFP 标记的HPV16VLP 的形成
• 4.3.6 EGFP 标记的融合蛋白的纯化和检测
• 4.3.6.1 Western blot 检测EGFP-HPV16L1 和EGFP-HPV16L1△NLS 融合蛋白
• 4.3.6.2 EGFP 的纯化和检测
• 4.3.6.3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测EGFP
• 4.3.7 小鼠红细胞凝集与凝集抑制试验
• 4.4 讨论
• 4.4.1 可表达EGFP 融合蛋白的PFB-EGFP 昆虫细胞杆状病毒表达载体的构建
• 4.4.2 HPV16 L1 蛋白的入核动力学过程
• 4.4.3 EGFP 标记的HPV16 L1VLP
• 4.4.4 NLS HPV16L1 对蛋白表达和纯化的影响
• 4.5 小结
• 第五章 NLS 影响DNA 疫苗诱发的体液免疫应答水平
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 质粒、菌株、细胞和实验动物
• 5.1.2 酶和抗体及主要试剂
• 5.1.3 主要溶液、培养基、缓冲液
• 5.1.4 主要仪器和设备
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 PCR 引物设计
• 5.2.2 重组PCDNA 真核表达载体的构建
• 5.2.2.1 pcDNA3.1（+）质粒制备
• 5.2.2.2 pFB-EGFP-HPV16L1 和pFB-EGFP-HPV16L1△NLS 质粒制备
• 5.2.2.3 EGFP-HPV16L1 和EGFP-HPV16L1△NLS 融合基因片段的获得
• 5.2.2.4 pcDNA3.1（+）质粒和融合基因片段的双酶切及回收
• 5.2.2.5 重组pcDNA3.1（+）真核表达质粒的构建和鉴定
• 5.2.3 重组PCDNA 真核表达质粒的大量提取及纯化
• 5.2.4 重组PCDNA 真核表达质粒转染CHO 细胞
• 5.2.5 重组质粒免疫BALB/C 小鼠
• 5.2.6 ELISA 法检测血清抗体
• 5.2.7 统计学处理方法
• 5.3 结果
• 5.3.1 重组PFAST-BAC 辅助表达载体的构建
• 5.3.2 重组PCDNA3.1 质粒转染CHO 细胞
• 5.3.3 ELISA 法检测血清抗体
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 第六章 抗HPV16L1 IGY 抗体的制备
• 6.1 实验材料
• 6.1.1 质粒、菌株、细胞和实验动物
• 6.1.2 主要试剂
• 6.1.3 主要溶液、培养基、缓冲液
• 6.1.4 主要仪器和设备
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 母鸡免疫程序
• 6.2.2 IGY 的分离及纯化
• 6.2.3 ELISA 法测定IGY 抗体效价
• 6.2.4 免疫组织化学染色
• 6.2.5 小鼠红细胞凝集抑制试验
• 6.3 结果
• 6.3.1 IGY 抗体效价的测定
• 6.3.2 免疫组化染色
• 6.3.3 小鼠红细胞凝凝集抑制试验
• 6.4 讨论
• 6.5 小结
• 第七章 HPV16 L1 抗原表位分析
• 7.1 实验材料
• 7.1.1 质粒、菌株
• 7.1.2 主要试剂
• 7.1.3 主要溶液、培养基、缓冲液
• 7.1.4 主要仪器和设备
• 7.2 实验方法
• 7.2.1 噬菌体随机肽库的筛选
• 7.2.1.1 噬菌体随机肽库的预筛选
• 7.2.1.2 噬菌体随机肽库的筛选
• 7.2.1.3 噬菌体的滴度测定
• 7.2.1.4 噬菌体的扩增
• 7.2.2 快速纯化噬菌体测序模板及测序
• 7.2.3 噬菌体序列分析
• 7.2.4 免疫斑点实验
• 7.3 结果
• 7.3.1 噬菌体随机肽库的筛选效率
• 7.3.2 免疫斑点实验
• 7.3.3 噬菌体单克隆测序与分析
• 7.4 讨论
• 7.5 小结
• 第八章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间的研究成果