烟碱类农药烯啶虫胺酶联免疫检测方法的建立

论文摘要

本论文对烟碱类农药烯啶虫胺残留的间接竞争酶联免疫检测方法（icELISA）进行了系统的研究。本实验以烯啶虫胺为原料,用3-巯基丙酸Cl原子取代,从而引入羧基活性基团,成功制备了半抗原。采用活化酯法将半抗原分别与牛血清蛋白（BSA）、卵清白蛋白（OVA）偶联制备免疫原和包被原,免疫原免疫大耳白兔以后,成功获得了特异性抗烯啶虫胺的多克隆抗体。通过优化方法工作条件,建立了一种简便、快捷、灵敏的烟碱类农药烯啶虫胺的间接竞争酶联免疫检测方法（icELISA）.间接竞争酶联免疫检测方法中包被原的包被浓度为0.05μg/well,抗体的稀释度为1：2000,缓冲液为浓度为0.05 mol L-1的PBS,封闭液为0.5%脱脂乳粉/PBS。此方法的灵敏度（IC50值）为2.18±0.22 ng mL-1,检测限（LOD,以IC15计算）为0.20±0.02 ng mL-1。烯啶虫胺抗体具有良好的特异性,与烟碱类农药吡虫啉、啶虫脒、噻虫啉的交叉反应率分别是1.49%、0.27%和0.28%,而与其他种类的农药的交叉反应率均低于0.01%。选取4种水样（纯净水、自来水、井水、河水）,4种果汁（番茄汁,苹果汁,橙汁,葡萄汁）,3种蔬菜（番茄,黄瓜,卷心菜）作为样品,进行了烯啶虫胺的添加回收实验,烯啶虫胺的回收率在62.8%～116.5%之间,板内变异系数为0.9%～9.9%,板间变异系数为1.70%～9.9%。ELISA的检测结果与气相色谱分析法（GC）的检测结果有很好的相关性,两种检测方法检测结果的线性回归方程为y=1.0076x-0.234,相关系数R2=0.9986。以上结果表明本研究建立的ELISA方法具有很高的准确度和精密度。本研究建立的烟碱类农药烯啶虫胺的间接竞争酶联免疫检测方法具有灵敏度高、特异性好、检测快速、检测成本低等优点,适用于水体、果汁和蔬菜样品中烟碱类农药烯啶虫胺残留的快速检测。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 农药概述
• 1.1.1 农药残留现状
• 1.1.2 农药残留的危害
• 1.1.3 农药残留的控制措施
• 1.2 烯啶虫胺的简介
• 1.2.1 烯啶虫胺的理化性质及作用机理
• 1.2.2 烯啶虫胺的毒性
• 1.2.3 烯啶虫胺的最高残留限量（MRLs）
• 1.3 烯啶虫胺残留常用的检测方法
• 1.3.1 气相色谱法
• 1.3.2 液相色谱法
• 1.3.3 联用技术
• 1.4 酶联免疫分析方法简介
• 1.4.1 免疫分析方法简介
• 1.4.2 酶联免疫分析方法原理
• 1.4.3 酶联免疫分析方法的主要类型
• 1.4.4 酶联免疫分析方法的建立
• 1.4.5 酶联免疫分析方法的参数及指标
• 1.4.6 酶联免疫分析方法研究现状及展望
• 1.5 本课题的研究目的及意义
• 1.6 本课题的研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要药品和试剂
• 2.1.2 仪器及材料
• 2.1.3 常用溶液的配制
• 2.1.4 待测样品
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 半抗原的合成
• 2.2.2 免疫原的制备
• 2.2.3 包被原的制备
• 2.2.4 烯啶虫胺多克隆抗体制备
• 2.2.5 间接竞争酶联免疫分析方法（icELISA）的研究
• 2.2.6 间接竞争ELISA法用于样品的检测
• 2.2.7 气相色谱分析法（GC）确证
• 2.2.8 间接竞争ELISA检测方法性能指标的评价
• 3 结果与讨论
• 3.1 烯啶虫胺半抗原的鉴定
• 3.2 抗血清的效价与亲和性的测定
• 3.3 烯啶虫胺抗体的纯化
• 3.4 间接竞争ELLSA工作条件的优化
• 3.4.1 包被量和抗体浓度的优化
• 3.4.2 封闭液的优化
• 3.4.3 标准品稀释液离子强度的优化
• 3.4.4 pH对间接竞争ELISA方法影响的研究
• 3.4.5 有机溶剂对间接竞争ELISA方法影响的研究
• 3.4.6 间接竞争ELISA方法标准曲线的建立
• 3.4.7 间接竞争ELISA方法的特异性
• 3.5 间接竞争ELISA法用于样品的检测
• 3.5.1 样品基质影响的消除
• 3.5.2 样品的添加回收实验
• 3.6 气相色谱分析法（GC）确证
• 3.7 间接竞争ELISA检测方法性能指标的评价
• 3.7.1 检测限与灵敏度
• 3.7.2 精密度
• 3.7.3 间接竞争ELISA稳定性实验
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读硕士学位期间发表论文情况
• 8 致谢