论文摘要
白癜风是一种获得性色素脱失性疾病,其发病机制尚不完全清楚。目前关于白癜风发病机制的学说有:神经学说、自身免疫学说、黑素细胞破坏学说、遗传学说等。近年来国内外大量研究表明,白癜风与自身免疫密切相关。白癜风患者血清中存在针对黑素细胞蛋白的自身抗体,已经发现的与白癜风密切相关的黑素细胞自身抗原有:酪氨酸酶（Tyrosinase）、酪氨酸相关蛋白-1（Tyrosinase related protein 1, TRP-1）、酪氨酸相关蛋白-2（Tyrosinase related protein 2, TRP-2）、黑素浓集激素受体-1（Melanin-concentrating hormone receptor 1, MCHR-1）,但这些抗原与白癜风患者血清抗体结合率低,不能完全解释白癜风的发病。尚有两个分子量为75、90kDa、被称为VIT 75及VIT 90的黑素细胞膜抗原性质一直不明。本课题组前期研究表明:黑素细胞抗原VIT 75等电点为6.5,与活细胞ELISA筛选出的白癜风患者血清的结合率为83%,明显高于既往已经发现的白癜风相关自身抗原,因此明确VIT 75的编码基因,深入探讨VIT 75的结构与功能,将有助于进一步理解VIT 75在白癜风中的作用,对阐明白癜风的免疫学发病机制有重要意义。目的:用双向电泳以及蛋白质印迹方法分离鉴定VIT 75,通过质谱及生物信息学技术明确VIT 75的编码基因序列。方法:[1]白癜风相关黑素细胞抗原VIT 75的鉴定原代培养黑素细胞,提取膜蛋白,借助双向电泳（2-dimensional electrophoresis,2-DE）分离黑素细胞膜蛋白,与白癜风患者和正常对照血清进行western blot,对比分析结果,鉴定VIT 75。[2]利用质谱以及生物信息学技术获得VIT 75的氨基酸序列用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱/串联质谱（Matrix assisted laser desorption ionization - time of flight mass spectrometry / time of flight, MALDI-TOF/TOF）对VIT 75进行氨基酸测序。通过Mascot引擎,将获得的氨基酸序列在NCBInr数据库内进行BLAST比对分析从而获得其核苷酸序列。应用在线软件对候选蛋白进行氨基酸序列分析,初步判断其潜在功能。[3]通过RT-RCR、western blot以及免疫细胞化学进行mRNA和蛋白水平的鉴定根据候选蛋白的核苷酸序列设计引物,通过RT-PCR检测该蛋白mRNA水平的表达;利用抗体通过western blot以及免疫细胞化学进行蛋白水平表达的检测。结果:[1]白癜风相关黑素细胞抗原VIT 75的鉴定通过2-DE分离黑素细胞膜蛋白,与白癜风患者和正常对照血清进行western blot,对比分析结果,发现在表观分子量为75KDa,等电点为6.5附近有一差别点;结果与我们课题组前期结果相符。[2]利用质谱以及生物信息学技术获得VIT 75的氨基酸序列用MALDI-TOF/TOF对VIT 75进行氨基酸测序。通过Mascot引擎,将获得的氨基酸序列在NCBInr数据库内进行BLAST比对分析,其中有四条氨基酸序列与八个蛋白匹配;应用软件BioEdit对候选蛋白进行聚类同源性分析分析,候选蛋白高度同源;应用DNAMAN软件对候选蛋白进行氨基酸序列比对,发现候选蛋白高度同源,氨基酸序列几乎完全相同;通过NCBInr数据库搜索发现候选蛋白为同一核苷酸序列的产物,geneID为10989,初步认为VIT 75为线粒体内膜蛋白mitofilin从而获得了VIT 75的编码基因;应用在线软件对mitofilin进行氨基酸序列分析,发现mitofilin具有跨膜结构,有多个磷酸化位点,没有糖基化位点。[3]通过RT-RCR、western blot以及免疫细胞化学进行mRNA和蛋白水平的鉴定通过mitofilin与黑素细胞膜蛋白双向电泳的western blot验证实验,进一步提示VIT 75为线粒体内膜蛋白mitofilin;RT-RCR实验表明在黑素细胞,黑素瘤细胞系11147以及角质形成细胞系HaCaT中均有mRNA水平表达; western blot结果显示,在黑素细胞以及HaCaT中均有mitofilin蛋白水平的表达,黑素细胞中略高于HaCaT;免疫细胞化学提示,mitofilin在HaCaT胞浆中表达,而在黑素细胞中,不仅胞浆表达,而且有部分表达于细胞膜上。结论:1.本研究首次利用MALDI-TOF/TOF初步获得了VIT 75的氨基酸序列,提示VIT 75为线粒体内膜蛋白mitofilin,并运用生物信息学对其氨基酸序列进行分析发现mitofilin具有跨膜结构,多处磷酸化位点修饰,可能在黑素细胞中具有重要的功能。2.通过验证试验进一步提示VIT 75为线粒体内膜蛋白mitofilin,首次提出在白癜风患者体内存在抗线粒体内膜蛋白mitofilin的自身抗体。3.本研究为白癜风发病的免疫学说提供了新证据和补充,对白癜风治疗策略的制定可能有一定意义。