论文题目: 成骨生长肽抗体的制备及其对NIH3T3细胞促增殖作用机理
论文类型: 博士论文
论文专业: 外科学
作者: 王晓峰
导师: 陈中伟,陈统一,崔大敷,施德源,姜晓幸
关键词: 成骨生长肽,成纤维细胞,促增殖活性,流式细胞测定,百日咳毒素
文献来源: 复旦大学
发表年度: 2005
论文摘要: 目的:成骨生长肽（OGP）是从损伤后再生的骨髓培养基质中分离纯化所得的一种具有14个氨基酸的小分子多肽。OGP广泛存在于哺乳动物的血清中,进化上高度保守,因此具有很好的同源性。研究发现OGP及其C端5肽可以促进造骨和造血作用。对体外培养的MC3T3E1成骨细胞、NIH3T3成纤维细胞和成骨性Rosl7/2细胞等均有促增殖和分化作用。但目前,OGP的细胞作用机理还不明确。为此,本实验采用中科院生化所人工合成的sOGP,设计poly-OGP制备OGP抗体,观察sOGP对NIH3T3细胞的促增殖作用,并利用制备抗体的免疫分析法及其他技术探讨OGP及其C端5肽对NIH3T3细胞的增殖作用机理。 方法:实验第一部分 Merrifield固相合成法合成寡肽。用Boc系统进行OGP的合成。HPLC、质谱分析鉴定其分子的均一性和准确性。制备多聚分支肽（Poly-OGP）和KLH-OGP。利用Poly-OGP及KLH-OGP作为抗原免疫新西兰兔制备抗血清。以抗血清利用放射免疫法（RIA法）及ELISA法测定sOGP浓度。 实验第二部分 将NIH3T3细胞以细胞浓度为5×104/ml,接种入96孔培养板,使用10%NCS-1640培养液,其中含不同浓度的sOGP或其sOGP（10-14）。48小时后以MTT法观察细胞增殖情况。将细胞浓度为5×104/ml的细胞培养液中的sOGP或sOGP（10-14）的浓度调整到10-11mol/l,48小时后以细胞计数法,细胞周期检测观察细胞增殖情况,以RT-PCR法及ELISA法观察Ⅰ型胶原的变化。 实验第三部分采用流式细胞FITC荧光染色法,观察在增殖浓度sOGP及sOGP（10-14）作用下的NIH3T3细胞膜表面OGP的变化。观察在OGP抗血清作用下,sOGP及sOGP（10-14）的促细胞增殖作用的变化。观察在百日咳毒素（PTX）,一种Gi抑制剂的作用下,OGP及OGP（10-14）的促细胞增殖作用,细胞膜OGP免疫荧光染色及细胞周期的变化。 结果:合成OGP经HPLC鉴定分子高度均一,纯度为99.28%,经质谱分析sOGP分子量为1523.5,与理论分子量1523.75相符。Poly-OGP的分子量平均为40KD左右。Poly-OGP可免疫动物得到可以测定的抗血清。 MTT法,细胞周期法,细胞计数法可以观察不同浓度sOGP及sOGP（10-14）
论文目录:
中文摘要
英文摘要
前言
正文
第一部分：成骨生长肽抗体的制备及鉴定
一. 半抗原和免疫抗原的合成
二. ~(125)I-OGP制备
三. 兔抗OGP的抗血清制备
四. OGP抗体的鉴定
五. 抗体的纯化
讨论
第二部分：合成成骨生长肽对NIH3T3细胞增殖作用活性的测定
一. MTT法测定sOGP对NIH 3T3细胞的增殖作用
二. NIH 3T3细胞在sOGP作用后细胞计数的变化
三. NIH 3T3细胞在sOGP作用后细胞周期的变化
四. NIH 3T3细胞在sOGP作用后Ⅰ型胶原PCR测定
五. NIH 3T3细胞在sOGP作用后Ⅰ型胶原测定
讨论
第三部分：成骨生长肽对NIH3T3细胞的作用机理研究
一. NIH 3T3细胞在sOGP作用后细胞膜表面OGP的变化
二. OGP抗体对sOGP(10-14)作用的影响
三. PTX预处理的NIH 3T3细胞在sOGP作用后细胞计数的变化
四. PTX预处理的NIH 3T3细胞在sOGP(10-14)作用后细胞膜免疫荧光的变化
五. PTX预处理的NIH 3T3细胞在sOGP(10-14)作用后细胞周期的变化
讨论
结论
参考文献
致谢
综述
论文独创性与使用授权声明
发布时间: 2005-09-19
参考文献
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