肺炎链球菌PsaA抗原及其在结合疫苗中的应用

论文摘要

作为一种自然界广泛存在的致病菌,肺炎链球菌可引起肺炎、脑膜炎、中耳炎、鼻窦炎和败血症等疾病。过去认为肺炎链球菌荚膜多糖抗原为肺炎链球菌主要致病因子,近年来,随着对肺炎链球菌致病机制的深入研究,发现肺炎链球菌一些自身蛋白可能为肺炎链球菌致病因子,这些蛋白在所有临床分离的肺炎链球菌菌株中均存在,可产生交叉免疫保护作用,而且蛋白疫苗产生的是T细胞依赖性免疫反应,对成人和儿童均有很好的保护作用。将肺炎球菌自身蛋白作为载体与多糖偶联制备蛋白多糖结合疫苗成为现在肺炎球菌疫苗的主要方向。目的:应用基因工程技术在原核E. coli和真核毕赤酵母GS115两种体系中表达和制备肺炎链球菌表面黏附素A（pneumococcal surface adhesin A,PsaA）,并与细菌荚膜多糖偶联制备成多糖蛋白结合疫苗,探讨PsaA作为肺炎球菌蛋白载体在结合疫苗中起到增强其它细菌多糖抗原免疫原性的同时,还能获得抗肺炎球菌的抗体反应,从而达到用一种结合疫苗能诱导出针对两种细菌的抗体免疫反应的目的。方法:从肺炎链球菌基因组中扩增psaA基因,将目的基因分别插入原核表达载体pET-28a（+）和真核表达载体pPIC9K,获得非融合表达的重组质粒pET28a-psaA和pPIC9K-psaA,通过转化分别进入大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115中,分别经IPTG和甲醇诱导,同采用DEAE-阴离子交换层析法纯化基因重组rPsaA蛋白。经过比较,将表达纯化较好的rPsaA蛋白与A群脑膜炎荚膜多糖（Group A Meningococcal Polysaccharide, GAMP）偶联成多糖蛋白结合疫苗后,用小鼠动物模型进行免疫实验,检测该疫苗的免疫原性,用ELISA法测定该疫苗在小鼠体内产生的针对肺炎球菌和脑膜炎球菌两种病原菌特异性抗原的抗体水平。结果:在原核E. coli中成功克隆基因重组表达质粒,而且表达的PsaA蛋白在载体上的组氨酸标签之前终止表达,不带有组氨酸标签,保证疫苗的安全性。SDS-PAGE技术分析表明:rPsaA蛋白高效表达,约为菌体蛋白的60%,蛋白分子量约为37 kD,而且蛋白的可溶性好,不形成包涵体,用DEAE-阴离子交换层析法纯化其纯度可达80%以上。纯化到的PsaA蛋白与GAMP多糖偶联成功,应用于小鼠免疫实验,PsaA蛋白载体能显著增强A群脑膜炎荚膜多糖抗原的免疫原性,并同时产生针对肺炎球菌蛋白抗原和脑膜炎球菌多糖抗原的特异性抗体。另外在真核毕赤酵母中也成功表达了rPsaA蛋白,目的蛋白表达量高达90%,纯度约70%。结论:利用基因工程技术在原核表达体系和真核毕赤酵母体系中均成功获得无组氨酸标签的rPsaA蛋白,并将它与A群脑膜炎荚膜多糖成功偶联,应用于小鼠免疫实验,在小鼠体内PsaA蛋白载体能显著增强A群脑膜炎荚膜多糖抗原的免疫原性,并同时产生针对肺炎球菌蛋白抗原和脑膜炎球菌多糖抗原的特异性抗体,提高疫苗的免疫保护效果。为探讨给儿童接种一种疫苗能同时预防肺炎和脑膜炎两种传染病的可能性提供研究基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1 PsaA 的结构
• 2 功能
• 3 重组PsaA 蛋白
• 4 应用前景
• 5 结论
• 第二章 肺炎链球菌psaA 基因在E. coli 中的克隆表达
• 1 引言
• 2 材料
• 2.1 菌体及抗体
• 2.2 主要试剂及工具酶
• 2.3 主要仪器设备
• 3 方法
• 3.1 肺炎链球菌基因组的提取
• 3.2 PCR 扩增目的基因
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 PCR 反应体系
• 3.2.3 PCR 反应条件
• 3.2.4 PCR 产物的浓缩
• 3.3 感受态大肠杆菌细胞制备
• 3.4 质粒转化
• 3.5 质粒DNA 的提取
• 3.6 双酶切质粒和目的基因片段
• 3.7 DNA 凝胶回收
• 3.8 目的基因片段与载体的连接
• 3.9 重组质粒pET28a-psaA 的鉴定
• 3.9.1 酶切鉴定
• 3.9.2 序列测定
• 3.10 诱导表达rPsaA 蛋白
• 3.10.1 PsaA 蛋白的小量诱导表达
• 3.10.2 PsaA 蛋白的大量诱导表达
• 3.11 rPsaA 蛋白的纯化
• 3.11.1 rPsaA 纯化条件的优化
• 3.11.2 rPsaA 蛋白的纯化
• 3.12 rPsaA 蛋白的透析
• 3.13 rPsaA 蛋白浓度的测定
• 3.14 Western-blot 鉴定PsaA 蛋白中无组氨酸标签
• 4 结果
• 5 讨论
• 6 小结
• 第三章 重组PsaA 在结合疫苗中的应用
• 1 引言
• 2 材料
• 3 方法
• 3.1 GAMP 的活化，衍生
• 3.2 载体蛋白的制备
• 3.2.1 蛋白含量的测定
• 3.2.2 rPsaA 的超滤浓缩
• 3.3 凝胶层析
• 3.4 GAMP-AH 和PsaA 的结合
• 3.5 GAMP-PsaA 的纯化
• 3.5.1 结合物纯化的预实验
• 3.5.2 结合物的纯化
• 3.6 GAMP-PsaA 的生化检测
• 3.6.1 ADH 含量检测
• 3.6.2 CNBr 残留量的检测
• 3.6.3 多糖含量检测
• 3.6.4 蛋白含量检测
• 3.6.5 EDAC 残留量检测
• 3.7 结合物分子大小分布，测KD 值
• 3.8 衍生物与结合物原液的抗原性检测
• 3.8.1 免疫双扩散法
• 3.8.2 抑制ELISA
• 3.9 小鼠免疫原性实验
• 3.9.1 免疫程序
• 3.9.2 血清学检测
• 3.9.3 直接法确定最佳酶标二抗工作浓度
• 3.9.4 确定最佳包被浓度
• 3.9.5 间接ELISA 测血清抗GAMP 特异性抗体水平
• 3.9.6 ELISA 测血清抗TT 特异性抗体水平
• 3.9.7 间接ELISA 测血清抗PsaA 特异性抗体水平
• 4 结果
• 5 讨论
• 6 小结
• 第四章 psaA 基因在毕赤酵母中的克隆表达
• 1 引言
• 2 方法
• 2.1 菌体及抗体
• 2.2 主要试剂及工具酶
• 2.3 主要仪器设备
• 3 方法
• 3.1 肺炎链球菌基因组的提取
• 3.2 PCR 扩增目的基因
• 3.2.1 引物设计
• 3.2.2 PCR 反应体系
• 3.2.3 PCR 反应条件
• 3.2.4 PCR 产物的浓缩
• 3.3 酵母感受态细胞的制备
• 3.4 质粒DNA 的提取
• 3.5 双酶切质粒和目的基因片段
• 3.6 DNA 凝胶回收
• 3.7 目的基因片段与载体的连接
• 3.8 重组质粒
• 3.8.1 酶切鉴定
• 3.8.2 序列测定
• 3.9 重组质粒线性化
• 3.10 酵母电转化
• 3.11 高产量菌种的筛选
• 3.12 小量发酵
• 3.13 扩大发酵
• 3.14 rPsaA 蛋白的纯化
• 3.15 rPsaA 蛋白的透析
• 3.16 rPsaA 蛋白浓度的测定
• 4 结果
• 5 讨论
• 6 小结
• 结论
• 1 已取得的成果
• 2 有待进行的研究
• 参考文献
• 附录一 缩略词中英文对照表
• 附录二 实验中使用的载体结构图
• 附录三 溶液的配制及仪器设备
• 攻读学位期间本人出版或公开发表的论著、论文
• 致谢