CD163及其它蛋白在PRRSV感染细胞过程中的相互作用

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猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）又名“蓝耳病”。是由PRRS病毒（PRRSV）感染所致的一种接触性传染病。该病以繁殖障碍、呼吸道疾病、哺乳仔猪的高死亡率、免疫抑制和持续性感染等为主要特征。其病原具有典型的嗜单核细胞/巨噬细胞特性,在体内,PRRSV主要感染猪肺泡巨噬细胞（Porcine alveolar macrophages, PAM）,在体外,主要感染非洲绿猴肾细胞系MA-104及其衍生物Marc-145。PRRSV感染宿主细胞首先通过与细胞膜表面上的特异受体结合,利用细胞的内吞作用而感染易感细胞。至今,已报道了四个独立但功能相关的PRRSV细胞受体。唾液酸粘附素（Sialoadhesin, Sn）、似肝磷脂蛋白（Heparan sulphate, HS）、波形蛋白（Vimentin）和清道夫受体（CD163）。研究发现HS主要作用是吸附PRRSV到PAM细胞上,Sn则介导病毒的内吞,CD163可能协助Sn内吞,病毒脱衣壳和将基因组RNA释放到细胞质中的作用。我们导师周恩民教授通过免疫共沉淀用单克隆抗独特型抗体Mab2-5G2（Mab2-5G2:针对抗GP5抗体）在猪肺泡巨噬细胞和Marc-145中提取到一个分子量约为230kD的蛋白质,可能是PRRSV的一个新的受体,经质谱分析和测序确定为非肌肉肌球蛋白ⅡA（Non-myscle myosinⅡA,NMHCⅡA）。在动物体内,非肌肉肌球蛋白Ⅱ有三种异构体:ⅡA,ⅡB,ⅡC。此蛋白广泛分布在整个生物体内,在细胞的吸附,迁移和胞质分裂中发挥重要的作用。可溶性CD163与非肌肉肌球蛋白重链A型存在着相互作用,但是,迄今为止CD163受体参与病毒结合的部位,病毒上参与受体结合的蛋白及其结合部位,受体与受体之间的关系以及CD163受体与我们发现的新蛋白非肌肉肌球蛋白的结合部位还不得而知。为确定CD163受体在PRRS病毒侵染过程中的作用以及与非肌肉肌球蛋白之间的关系,本实验分别从猪肺泡巨噬细胞（PAM）和非洲绿猴肾细胞（Marc-145）中经RT-PCR扩增出编码CD163受体的全长基因,并克隆到pcDNA3.1/V5-His A载体中,得到表达CD163受体的真核表达载体。猪肾PK-15细胞和幼仓鼠肾细胞BHK-21为PRRSV非易感细胞系,将表达载体转染PK-15和BHK-21细胞后接种PRRSV,然后利用PRRSV的核衣壳蛋白（Nucleocapsid,N）的单克隆抗体进行间接免疫荧光检测病毒的情况。结果发现表达CD163蛋白的PK-15细胞/BHK-21细胞能够感染PRRSV。并且发现,CD163在PK-15和BHK-21细胞中的转染效率是有很大差别的,CD163在BHK-21中的转染效率约为10%,而在PK-15中的转染效率约为30%。在此基础上,共转染全长的CD163和真核表达的非肌肉肌球蛋白ⅡA羧基端330AA的蛋白PRA于非易感细胞系BHK-21,按100TCID50接PRRSV-12#,通过间接免疫荧光实验发现病毒感染量增加。以上实验结果显示CD163和PRA在PRRSV感染过程中可能起协同作用;为了证明NMHCⅡA与PRRSV的关系,Marc-145细胞被PRRSV感染,并在不同时间内固定,通过共聚焦显微镜发现,PRRSV在4℃时,主要吸附在细胞的表面,转入37℃后,大约5min,开始进入细胞内部,随着时间的延长,病毒进入细胞,则发现NMHCⅡA的表达量增多,在60min时PRRSV完全进入细胞,NMHCⅡA的表达量也开始减少。上述实验揭示,NMHCⅡA可能与PRRSV感染细胞有关。使用Scanprosite软件分别对猪肺泡巨噬细胞（PAM）和Marc-145细胞的CD163蛋白结构和功能域进行预测。CD163有1个信号肽和9个SRCR结构域（Scavenger receptor cystein-rich domain）,在SRCR 6和SRCR 7之间有一个富含脯氨酸-丝氨酸-苏氨酸（proline-serine-threonine,PST）区域。第二个PST区域则与SRCR 9相连。在CD163的羧基端含有一个跨膜区和一个短的胞质尾部。对于PAM,全长的CD163有1115个氨基酸组成,SRCR 1-9在CD163中的位置分别是54AA-151AA,161AA-258AA,268AA-365AA,375AA-472AA,480AA-577AA,585AA-682AA,721AA-818AA,828AA-925AA,931AA-1028AA;第一个PST区域所在的位置是683AA-720AA;第二个PST以及胞质尾部在1029AA-1115AA之间。对于Marc-145细胞的CD163,还没有人报道其全长序列,根据Vero细胞和PAM的CD163核苷酸序列的高度同源性,设计引物,经RT-PCR扩增出其全长序列是1117个氨基酸,首次在GenBank上注册,其基因序列号是JF753553。其SRCR 1-9在CD163中的位置分别是54AA-152AA,162AA-259AA,269AA-366AA,376AA-473AA,481AA-578AA,586AA-683AA,722AA-819AA,831AA-926AA,932AA-1029AA。第一个PST位置是684AA-721AA;第二个PST以及胞质尾部在1030AA-1116AA之间。通过SignalP信号预测软件预测知CD163氨基端1-16个核苷酸是信号肽,它指导着CD163的跨膜转移。根据CD163基因的结构特征以及相关的文献,本实验进一步将PAM和Marc-145细胞中的CD163受体基因各分割成3段。根据其来源不同将PAM中的CD163片段命名为P1,P2,P3; Marc-145细胞中的CD163片段命名为M1,M2,M3。经RT-PCR将各个片段克隆到PMD18-T载体,并将各个片段分别构建于真核表达载体pcDNA3.1/v5-His A和pEGFP-N1中。命名为Z-P1,Z-P2,Z-P3;Z-M1,Z-M2,Z-M3。Z-P1（798bp）,在全长中的位置1-798bp;Z-P2在790bp-2046bp之间,共1257bp;Z-P3是2023bp-3345bp（1323bp）;Z-M1含有777bp从1bp-777bp;M-2则从763bp-2049bp,共为1287bp;M3是1317bp,从CD163全长的2035bp到3351bp。分别将它们转染非易感细胞系BHK-21和PK-15,并对转染条件进行优化。结果发现P3和M3转染效率最高,P2,M2次之,P1,M1最低。同时,发现短片段的CD163在BHK-21细胞中的转染效率比在PK-15中的高。转染的细胞接入PRRSV后,通过PRRSV的N蛋白单克隆抗体,发现转染P1,M1的非易感细胞并不被PRRSV感染,而P2,M2和P3,M3则能够被病毒感染,并且发现转染P2,M2的非易感细胞病毒感染量要强于P3,M3。说明CD163的SRCR1-2并不参与病毒的感染,SRCR4-6对PRRSV复制起主要作用。为了进一步研究CD163在病毒感染中的作用以及PRRSV受体与受体、受体与PRRSV的蛋白、受体与非肌肉肌球蛋白（ⅡA,ⅡB）之间的关系,将分段的CD163片段进行原核表达。通过稀有密码子Graphical codon analysis分析软件,发现CD163序列中含有很多的稀有密码子,不利于蛋白的表达,为了蛋白表达,将P1,M1,P3,M3基因进一步的截短,截短的基因分别命名为Y-P1,Y-M1,Y-P3,Y-M3。其大小分别变为639bp,618bp,942bp和978bp,在CD163中的原位置依次变为160bp-798bp,160bp-777bp,2143bp-3084bp和2143bp-3120bp。将构建的重组质粒pET-28a-Y-（P1,P2,P3,M1,M2,M3）测序检测没有移码和突变,转入Rosetta感受态细胞并进行诱导表达。经SDS-PAGE分析,表达的重组蛋白大小分别约为24KD,46KD,35KD,22KD,46KD和36kD,与预期的结果相吻合。经Western-blot检测,所获得的各段重组蛋白均能与抗His-单克隆抗体发生特异性反应。将纯化的重组蛋白分别免疫Balb/c小鼠,三免后,获得高免的小鼠血清。根据血清病毒阻断实验,发现Y-P3和Y-M3小鼠血清在1/20和1/40的时候,能够阻断病毒感染,而Y-P2和Y-M2不仅没有阻断反而稍微增强,而Y-P1和Y-P2则与对照没有明显的区别;蛋白结合实验,发现纯化复性的CD163片段能够与Marc-145结合,通过荧光强度和细胞数量,证明在200μg/ml的条件下P1和M3结合最弱。蛋白结合实验证明CD163各片段可能结合Marc-145细胞上的某蛋白;为了证明CD163片段与NMHCⅡA的关系,通过免疫共沉淀技术以及Western Blot实验,发现M1和M3能够结合NMHCⅡA;在原核表达水平上,通过ELISA实验,证明GP5蛋白不与CD163各个片段相互作用,而当将GP5的几个抗原表位（GP5-1,GP5-2,GP5-3,Gp5-4）分段表达时,发现GP5-1与P1,P3和M1存在着一定的相互作用;GP5-2与P1,P3,M1有相互作用;GP5-4则与P1,M1;而GP5-3则与CD163各片段不存在相互作用。唾液酸粘附素Sn的分段蛋白Sn-1,Sn-3分别与CD163各个片段进行孵育,发现Sn-1与P1,M1,M3存在着相互作用,而Sn-3则与M1和M3有一定的相互作用。同时,还证明PRA与P3,M1相互作用,而PRB（非肌肉肌球蛋白ⅡB羧基端267AA处）则与P1,P2,P3和M1。

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Abstract

1 引言

1.1 猪繁殖与呼吸综合征概述

1.2 PRRSV 生物学特性

1.2.1 PRRSV 的分类地位

1.2.2 PRRSV 的形态结构

1.2.3 PRRSV 的基因组结构

1.2.3.1 PRRSV 的非结构蛋白

1.2.3.2 PRRSV 的结构蛋白

1.3 PRRSV 免疫学与致病机制的研究进展

1.3.1 体液免疫反应

1.3.2 细胞免疫反应

1.3.3 PRRSV 的致病机制

1.4 病毒的细胞受体

1.4.1 病毒受体的概述

1.4.2 病毒侵入宿主细胞的过程

1.4.3 鉴定受体的方法

1.5 猪繁殖与呼吸综合征病毒受体的研究进展

1.5.1 细胞上的PRRSV 受体

1.6 研究目的和意义

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 细胞、毒株和抗体

2.1.2 实验动物

2.1.3 主要试剂与药品

2.1.4 载体和菌种

2.1.5 主要试剂配制

2.1.6 主要设备及仪器

2.2 实验方法

2.2.1 细胞的培养及传代

2.2.2 引物设计及合成

2.2.3 间接免疫荧光试验（IFA）

2.2.3.1 阳性猪血清/单克隆抗体检测

2.2.3.2 非肌肉肌球蛋白ⅡA 与PRRSV 的检测

2.2.3.3 蛋白结合Marc-145 细胞的检测

50的测定'>2.2.4 PRRS 病毒TCID₅0的测定

2.2.5 小鼠血清PRRSV 阻断实验

2.2.6 细胞的收集

2.2.6.1 PAM 细胞的收集

2.2.6.2 Marc-145 细胞的收集

2.2.7 总RNA 的提取

2.2.8 目的基因的胶回收

2.2.9 连接反应

2.2.10 大肠杆菌感受态细胞的制备（DH5α/TOP10/ Rosetta）

2.2.11 大肠杆菌细胞（DH5α/TOP10/ Rosetta）的转化

2.2.12 大肠杆菌中质粒的提取

2.2.13 重组质粒的PCR 鉴定

2.2.14 重组质粒的构建及鉴定

2.2.14.1 重组pcDNA3.1/V5-His A-CD163 质粒的构建及鉴定

2.2.14.2 重组质粒pEGFP-N1-Y-（P1, P2, P3, M1, M2, M3）的构建及鉴定

2.2.14.3 重组质粒pET-28a（+）-Y-（P1, P2, P3, M1, M2, M3）的构建及鉴定

2.2.15 重组质粒的酶切鉴定

2.2.16 重组质粒的序列分析鉴定

2.2.17 重组质粒的诱导表达

2.2.18 SDS-PAGE 蛋白质电泳分析

2.2.18.1 SDS-PAGE 蛋白质样品的制备

2.2.18.2 SDS-PAGE 蛋白质电泳（参照分子克隆实验指南操作）（萨姆布鲁克,2002）

2.2.19 诱导条件的筛选及优化

2.2.20 重组蛋白的大量表达

2.2.21 重组蛋白的纯化

2.2.22 重组蛋白的复性

2.2.23 蛋白浓度的测定

2.2.24 免疫Balb/c 小鼠

2.2.25 间接ELISA 检测方法的建立及判定标准

2.2.26 间接ELISA 检测小鼠免疫后的抗体水平

2.2.27 CD163 重组质粒的纯化、转染与其介导病毒结合能力的检测

2.2.28 CD163 重组质粒转染后的稳定筛选

2.2.29 非肌肉肌球蛋白ⅡA（NMHCⅡA）的提取

2.2.29.1 Marc-145 细胞的传代

2.2.29.2 Marc-145 细胞的收集

2.2.29.3 免疫共沉淀（IP）

2.2.29.4 SDS-PAGE 检测

2.2.29.5 Western Blot 检测

2.2.29.6 非肌肉肌球蛋白ⅡA（NMHCⅡA）的纯化

2.2.30 ELISA 方法检测蛋白之间的相互作用

2.2.30.1 ELISA 检测蛋白之间相互作用的方法A

2.2.30.2 ELISA 检测蛋白之间相互作用的方法B

3 结果与分析

3.1 PAM 中CD163 全长基因的获得

3.2 MARC-145 细胞中CD163 全长基因的获得

3.3 CD163 结构和功能域的预测

3.4 CD163 片段中SRCR 同源性的比较

3.5 CD163 分段基因的获得

3.6 全长CD163 真核表达载体的构建

3.7 CD163 片段表达载体的构建

3.7.1 CD163 片段真核表达载体的构建

3.7.2 CD163 片段原核表达载体的构建

3.8 CD163 片段蛋白的诱导表达及SDS-PAGE 检测

3.9 间接ELISA 方法检测小鼠抗体水平及其效价

3.10 CD163 分段蛋白结合MARC-145 细胞

3.11 小鼠血清阻断PRRSV 感染宿主细胞

3.12 非肌肉肌球蛋白ⅡA（NMHCⅡA）的提取及检测

3.13 CD163 片段与NMHCⅡA 的相互作用

3.13.1 Western Blot 检测

3.13.2 ELISA 检测CD163 片段与各蛋白的相互作用

3.13.2.1 CD163 各片段与PRA 蛋白的作用

3.13.2.2 CD163 各片段与PRB 蛋白的作用

3.13.2.3 CD163 各片段与非肌肉肌球蛋白ⅡA 蛋白的作用

3.14 NMHCⅡA 与PRRSV 感染的关系

3.15 全长CD163 介导病毒的感染

3.16 转染CD163 细胞的稳定筛选

3.17 分段CD163 介导病毒的感染

3.18 全长CD163 和PRA 共转染介导病毒的感染

4 讨论

5 结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况

博士学位论文内容简介及自评

CD163及其它蛋白在PRRSV感染细胞过程中的相互作用

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