马麝朊蛋白基因的克隆与原核表达

论文摘要

【目的】为了解马麝朊蛋白基因结构特征和其细胞型朊蛋白的性质,以填补国内外对马麝朊蛋白基因研究的空白,并为进一步研究马麝朊蛋白结构特征和动物朊病毒病传染的种间屏障机制提供实验材料和理论依据,本研究准备对马麝朊蛋白基因进行克隆及其原核表达。【方法】应用分子克隆和DNA重组技术,以健康成年马麝全血中提取的基因组总DNA为材料,用所设计引物以PCR扩增细胞型朊蛋白基因,并克隆目的DNA片段到pMD 18-T载体,建立完整朊蛋白基因克隆,测序后以DNAstar软件比较分析其核苷酸和推导氨基酸序列特征及其同源性;以马麝完整朊蛋白基因重组质粒为材料,PCR扩增表达目的基因片段,构建重组表达质粒pGEX-MuPrP（85～233）,转化E.coli BL21（DE3）,进行诱导表达条件优化和重组菌的诱导表达,以SDS-PAGE和Western blotting鉴定表达产物,从而建立马麝重组朊蛋白（85～233）的原核表达菌GST-MuPrP（85～233）。【结果】序列分析表明,4 个马麝朊蛋白基因的完整编码区均为包含在单一外显子内完整开放阅读框,其全长为771 bp,含5 个短而富含G-C 的元件,可编码5 个八肽（九肽）重复Pro-His-Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln 或Pro-Gln/His-Gly-Ala/Gly-Gly-Gly-Trp-Gly-Gln 及24 个氨基酸的N-端信号肽和23 个氨基酸的C-端信号肽。与同科不同亚科的马鹿和白尾鹿以及不同科的奶牛和绵羊朊蛋白基因序列比较,核苷酸序列和推导氨基酸序列同源性为97.3%～98.2%和97.7%～98.8%,说明朊蛋白基因在同科和不同科的反刍动物间是保守的。马麝朊蛋白基因与马鹿和白尾鹿相比,存在G57A、S100N、N173S、T177N 和M208I 5 个异义突变;与绵羊相比,存在G57A、S98T和S100N 3 个异义突变;与牛相比,除缺失一个八肽重复外,还存在G57A、G100N、S146N、H158Y、E189Q 和M208I 6 个异义突变。G57A 突变发生于第一个重复九肽的第4 位,该突变在已知人和动物朊蛋白基因中未曾发现,为马麝朊蛋白基因所特有。所构建的马麝重组朊蛋白（85～233）原核表达载体pGEX-MuPrP（85～233）,经转化E.coli BL21（DE3）,成功地获得重组表达菌E.coli GST-MuPrP（85～233）,可表达预期大小约为42.4 ku的融合蛋白。在诱导表达优化条件下,该重组菌可产生表达量占细菌总蛋白量30%以上的融合蛋白。免疫印迹检查,融合蛋白GST-MuPrP（85～233）可与抗牛单克隆抗体4C11 反应,各氨基酸突变并不影响单抗4C11 的识别表位。

论文目录

• 摘要
• 第一篇 文献综述 朊蛋白基因的结构特征
• 0 前言
• 1 PrP基因
• 1.1 基因的基本结构特征
• 1.1.1 PrP基因的位置
• 1.1.2 PrP基因组的组成结构
• 1.1.3 PrP基因编码区的结构特征
• 1.2 不同哺乳动物的朊蛋白基因结构特征
• 1.2.1 HuPrP基因
• Sc的二级结构特点'>1.2.2 PrP^Sc的二级结构特点
• 1.2.3 SHePrP基因
• 1.2.4 BoPrP基因
• 1.2.5 恒河猴PrP基因
• 1.2.6 熊猫PrP基因
• 1.3 哺乳动物PrP基因的比较
• 2 朊蛋白基因的多态性
• 2.1 绵羊PrP基因的密码子136和171多态性
• 2.2 绵羊PrP基因的密码子1361、54和171多态性
• 2.3 绵羊PrP基因的其他多态性和其相关基因
• 2.3.1 PrP基因其他密码子多态性
• 2.3.2 Sip基因和PrP基因限制性片段长度多态性
• 2.4 山羊PrP基因的突变
• 2.5 牛PrP基因的多态性
• 2.6 不同动物的PrP基因多态性与朊粒病
• 3 总结
• 第二篇 研究报告 马麝朊蛋白基因的克隆与原核表达
• 1 前言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 血样
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 主要仪器与设备
• 2.1.4 朊蛋白基因参考序列
• 2.2 朊蛋白基因的克隆
• 2.2.1 引物的设计和合成
• 2.2.2 马麝总DNA的提取
• 2.2.3 目的基因的PCR扩增
• 2.2.4 PCR产物的电泳和回收
• 2.2.5 重组质粒的构建与鉴定
• 2.2.6 重组质粒的测序和序列分析
• 2.3 马麝重组朊蛋白（MuPrP）的原核表达
• 2.3.1 引物设计与合成
• 2.3.2 目的DNA片段的PCR扩增与回收
• 2.3.3 pGEX-4T-1质粒DNA和目的DNA片段的酶切与回收
• 2.3.4 重组表达质粒的构建及鉴定
• 2.3.5 重组菌的诱导表达和条件优化
• 2.3.6 表达产物的鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 朊蛋白基因的PCR扩增
• 3.2 朊蛋白基因阳性克隆的PCR扩增和酶切鉴定
• 3.2.1 PCR扩增鉴定
• 3.2.2 酶切鉴定
• 3.3 马麝朊蛋白基因的测序结果及序列分析
• 3.3.1 朊蛋白基因核苷酸测序结果
• 3.3.2 朊蛋白基因核苷酸序列和推导氨基酸序列的同源性分析
• 3.3.3 朊蛋白基因突变位点分析
• 3.4 重组PrP表达质粒的鉴定
• 3.5 重组菌诱导表达优化条件
• 3.6 表达产物的鉴定
• 3.6.1 SDS-PADE鉴定
• 3.6.2 免疫印迹鉴定
• 4 讨论
• 致谢
• 参考文献
• 缩写词英汉对照表
• 作者简介
• 导师简介
• 独创性声明