论文摘要
恶性脑胶质细胞瘤是颅内常见的原发肿瘤,外科手术结合术后放疗、化疗,患者的中位生存时间一般少于18个月。硼中子俘获疗法（boron neutron capture therapy, BNCT）是一种新型的放射疗法,可以选择性地杀死肿瘤细胞,对正常脑组织损伤较少。然而其杀伤胶质瘤细胞的机理尚不清楚。在本课题中,采用对二羟苯丙氨酸硼（L-p-Borono-phenylalanine,BPA）作为硼携带剂,应用铀氢皓核反应堆作为中子源,进行胶质瘤细胞的BNCT试验。对比研究BNCT与γ射线对胶质瘤细胞的作用,研究中子剂量与诱导细胞凋亡的关系,并探讨其诱导细胞凋亡的机制;同时制作小鼠G422脑胶质细胞瘤模型,应用BNCT系统,围绕临床上放射治疗常采用的剂量,观察BNCT治疗脑胶质细胞瘤的效果,对比研究BNCT与γ射线对荷瘤小鼠的治疗作用,以及中子剂量和治疗效果的关系。本课题分为2个部分:1.硼中子俘获疗法诱导U87、U251、SHG44胶质瘤细胞凋亡; 2.硼中子俘获疗法治疗荷G422脑胶质细胞瘤小鼠的研究。1.硼中子俘获疗法诱导U87、U251、SHG44胶质瘤细胞凋亡:为了探讨BNCT对人脑胶质瘤细胞系U87、U251、SHG44的增殖抑制和诱导凋亡的作用及可能机制,将处于对数生长期的U87、U251、SHG44胶质瘤细胞在含BPA的培养液中分别培养3、6、12、24 h后采用感应耦合等离子体原子发射光谱（ICP-AES）法测定细胞内的硼浓度。将对数生长期的U87、U251、SHG44细胞分为未照射组、γ射线对照组（4、8 Gy）、反应堆组、BNCT组（4、8 Gy）。应用光镜、荧光显微镜、透射电子显微镜观察BNCT后细胞形态改变,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法绘制细胞生长曲线,使用流式细胞仪检测细胞凋亡率,利用细胞克隆形成实验分析细胞存活分数,以免疫组织化学技术检测P53、BCL-2蛋白的表达,应用western blot半定量检测BCL-2、BAX蛋白表达的变化。结果显示,在体外试验中,BNCT明显抑制了U87、U251、SHG44细胞的增殖,硼-中子照射后细胞早期即出现典型的凋亡形态改变。BNCT 4、8 Gy组细胞生长抑制作用显著高于同等剂量的γ射线照射组（P<0.01）。BNCT 4、8 Gy处理后48 h,U87细胞的凋亡率分别为63.6%、85.9%,U251细胞的凋亡率分别为57.7%、80.6%,SHG44细胞的凋亡率分别为60.9%、88.3%,显著高于各对照组（P<0.01）。BNCT 4、8 Gy处理后,U87细胞、U251细胞、SHG44细胞的存活分数均小于0.01%,显著低于各对照组（P<0.01）。免疫组化结果显示:未照射的U87、U251、SHG44细胞中P53蛋白表达阴性,BNCT 4、8 Gy处理后U87、U251、SHG44细胞中P53蛋白表达阳性。未照射的U87、U251、SHG44细胞中BCL-2蛋白表达阳性,BNCT 4、8 Gy处理后BCL-2蛋白表达阴性。western blot结果显示:BNCT 4、8 Gy处理后U87、U251、SHG44细胞中BCL-2蛋白表达随时间延长而下降,BAX蛋白表达随时间延长而上升。上述结果说明,BNCT显著抑制了U87、U251、SHG44细胞的增殖,并有剂量、时间依赖性特点,这可能是通过上调P53基因、BAX基因表达,抑制BCL-2基因表达,诱导细胞发生了凋亡所致。2.硼中子俘获疗法治疗荷G422脑胶质细胞瘤小鼠的研究:为了研究硼中子俘获疗法以不同剂量治疗G422胶质细胞瘤的效果,及BNCT与γ射线治疗效果的差异,制作小鼠颅内G422胶质细胞瘤模型,BPA腹腔注射荷瘤小鼠,采用ICP-AES法测定荷瘤小鼠不同组织内的硼浓度随时间的变化趋势。将荷瘤小鼠随机分为未照射组（0 Gy）、γ射线对照组（5、10 Gy）、反应堆组（5、10 Gy）、BNCT组（5、10 Gy）。采用生存时间中位数（median survival time,MeST）、平均生存时间(（mean survival time,MST）、生存曲线、生存延长百分率（the percent increased life span,%ILS）作为评价指标,观察各组的治疗效果。结果表明,硼-中子5、10 Gy照射后,荷G422胶质细胞瘤小鼠的%ILS分别为108%（117%）、321%（300%）。硼-中子5、10 Gy照射后,小鼠的MST分别为21.750 d、27.875 d,显著高于未照射组（P<0.01）,并明显高于同剂量反应堆组（P<0.05）和同等剂量γ射线照射组（P<0.01）,BNCT 10 Gy组生存时间高于BNCT 5 Gy组（P<0.01）。结论提示,BNCT明显延长了荷G422胶质细胞瘤小鼠的生存时间,并且在一定剂量范围内,随着剂量增加,疗效越明显,且优于同等剂量的γ射线照射。