出芽短梗霉产普鲁兰糖相关基因的克隆与敲除

论文摘要

出芽短梗霉（Aureobiasidium pullulans）是一种多形态真菌,在其酵母状细胞内可分泌一种胞外多糖——出芽短梗孢糖（pullulan）,又称普鲁兰糖,其分子由麦芽三糖α-1,6-糖苷键连接而成。该糖无色、无味,对人体无任何毒副作用,具有优良的水溶性、成膜性等独特的化学和生物学特性,广泛应用于医药、食品、化妆品.烟草和农业等领域,是具有较大经济价值和开发潜力的多功能生物产品。鉴于普鲁兰糖在生产中广泛的应用前景,广大研究人员希望通过物理、化学等诱变技术获得普鲁兰糖产量高的菌株。但由于菌株遗传的不稳定性,较难得到理想的菌株。分子生物学、基因工程等学科的飞速发展,为产生普鲁兰糖相关的基因进行研究提供研究条件。本研究试图通过表达谱的分析和不同蛋白质序列的测定,找到和普鲁兰糖代谢相关的基因,为获得普鲁兰糖高产工程菌株打下基础。本实验从蛋白差异性入手,将培养1-3天的出芽短梗霉菌液收集离心。菌体破菌后进行SDS-PAGE的长胶电泳,发现培养1,2和3天的菌体蛋白表达量有差异。将20条差异蛋白的条带切下后,进行质谱分析,获得了18种参考蛋白,其中3-磷酸甘油醛脱氢酶多次出现,推测此酶可能与普鲁兰糖代谢相关。取3-磷酸甘油醛脱氢酶基因设计简并引物,以基因组DNA为模板,扩增出大约280bp的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因片段。通过Genbank进行Blast比对后发现,其核酸序列与毛壳菌、霉菌等亲缘菌的3-磷酸甘油醛脱氢酶基因有极高的相似度。利用短侧翼同源区PCR的方法设计一段含3-磷酸甘油醛脱氢酶基因侧翼和Zeocin抗生素基因的同源序列,以pPICZa质粒为模板进行扩增,扩增出含3-磷酸甘油醛脱氢酶基因侧翼的Zeocin抗生素片段。将片段电击转化入出芽短梗霉细胞,利用报告基因Zeocin筛选到5株重组克隆子。通过PCR验证,获得了2个敲除3-磷酸甘油醛脱氢酶基因片段的工程菌。通过显微镜观察,发现重组克隆菌形态比出发菌体积小,产糖量也少。结果说明3-磷酸甘油醛脱氢酶基因在出芽短梗霉的普鲁兰糖代谢中发挥重要作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 出芽短梗霉
• 1.1.1 出芽短梗霉的菌落特征
• 1.1.2 出芽短梗霉的菌种选育
• 1.2 普鲁兰糖
• 1.2.1 普鲁兰糖的结构
• 1.2.2 普鲁兰糖的性质及用途
• 1.2.3 普鲁兰糖产生的合成机制的探究
• 1.3 出芽短梗霉的发酵
• 1.3.1 发酵产量与PH的关系
• 1.3.2 发酵产量与温度的关系
• 1.3.3 发酵产量与溶氧量的关系
• 1.4 分子水平的研究
• 1.4.1 基因重组技术
• 1.4.2 基因敲除技术
• 1.4.3 3-磷酸甘油醛脱氢酶
• 1.4.4 质粒pPICZα与Zeocin抗生素
• 1.5 本实验研究方法与目的
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株质粒引物
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 主要缓冲液
• 2.2 方法
• 2.2.1 出芽短梗霉的培养和保藏
• 2.2.2 SDS-PAGE检测菌体蛋白
• 2.2.3 电泳结果分析及质谱分析
• 2.2.4 简并引物的设计
• 2.2.5 出芽短梗霉基因组DNA的提取
• 2.2.6 3-磷酸甘油醛脱氢酶基因片段的克隆
• 2.2.7 3-磷酸甘油醛脱氢酶基因片段的敲除
• 3 结果与分析
• 3.1 出芽短梗霉的镜检结果
• 3.2 SDS-PAGE电泳结果
• 3.3 出芽短梗霉基因组DNA的提取
• 3.4 PCR扩增3-磷酸甘油醛脱氢酶基因
• 3.5 蓝斑菌落和白斑菌落质粒大小对比
• 3.6 PCR验证疑似重组子
• 3.7 疑似重组子测序结果
• 3.8 SFH-PCR法扩增Zeocin抗生素基因
• 3.9 Zeocin抗生素对出芽短梗霉最低杀伤浓度的确定
• 3.10 片段电击转化入出芽短梗霉
• 3.11 转化菌PCR验证
• 3.12 3-磷酸甘油醛脱氢酶基因片段敲除前后菌株细胞形态特征
• 3.13 3-磷酸甘油醛脱氢酶基因片段敲除前后菌株产普鲁兰糖变化
• 4 讨论与展望
• 4.1 差异蛋白的筛选
• 4.2 简并引物的设计
• 4.3 PCR反应聚合酶的选择
• 4.4 出芽短梗霉感受态细胞的制备
• 4.5 展望
• 参考文献
• 致谢