达坂喜盐芽孢杆菌D-8～T四氢嘧啶合成基因的克隆、功能表达和谷氨酰胺转运蛋白基因的克隆

论文题目: 达坂喜盐芽孢杆菌D-8～T四氢嘧啶合成基因的克隆、功能表达和谷氨酰胺转运蛋白基因的克隆

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物学

作者: 赵百锁

导师: 杨苏声

关键词: 达坂喜盐芽孢杆菌,四氢嘧啶,谷氨酸胺,反向,核磁共振技术

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 达坂喜盐芽孢杆菌（Halobacillus dabanensis）D-8T分离自我国新疆地区达坂盐湖,属于革兰氏阳性中度嗜盐菌。根据革兰氏阳性菌四氢嘧啶合成基因ectABC的蛋白氨基酸的保守序列,设计了AP1和BP2以及BP1和BP2两对简并引物,以菌株D-8T基因组DNA为模板进行PCR扩增后,经过序列测定和Blastx比较,获得了ectABC基因的部分DNA片段。然后将经过地高辛标记试剂盒标记的ectA-ectB探针,与菌株D-8T基因组DNA进行Southern杂交。经过两次反向PCR,获得了11.2kbDNA片段。对该序列进行ORF编码框分析,结果表明存在7个方向不一致的ORF碥码框,依次为orf1、orf2、ectA、ectB、ectC、orf3和orf4。被预测的的氨基酸数目分别是398、300、184、428、129、163和361个氨基酸,其对应的蛋白分子量依次为43508、33956、20921、46969、14956、18369和42186 Da。分析表明启动子可能的-10和-35区与大肠杆菌的σ70因子依赖的启动区有很大的相似性,而控制全细胞抗性压力的σB因子在菌株D-8TectABC基因上游的启动区中却没有被发现。ectABC基因在结构上比其它物种的更加紧凑。把重组质粒pMXB10ectdBC转化到大肠杆菌（Escherihia coil）ER2566中,在LB培养基中,于25℃条件下培养4小时后,用IPTG进行诱导过夜,然后提取细胞内的相容性溶质。13CNMR检测发现在图谱上存在四氢嘧啶相对应的波峰。 本实验设计了一种适合菌株D-8T生长的合成培养基（SSDM）,该菌株在SSDM生长的总盐浓度范围约为3%到20%,其最适宜的总盐浓度为5%到15%。实验发现,菌株D-8T最适合的碳源为甘油和葡萄糖,而蔗糖、甘氨酸甜菜碱、山梨糖、脯氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺等有机物质也可以作为碳源。通过13C NMR检测,发现D-8T菌株在含10%盐度的SSDM、含15%盐度的SSDM、M63和G10中能够合成丙氨酸、谷氨酸和乙酰鸟氨酸等相容性溶质,其中在G10生长的细胞内发现含有四氢嘧啶的微弱信号。该菌分别在含5%和10%盐度受到渗透冲击2小时后,其细胞内积累的主要相容性溶质是谷氨酸和乙酰鸟氨酸。 为了研究菌株D-8T的谷氨酰胺转运蛋白系统,经过两次反向PCR,获得了glnABC转运蛋白基因转运蛋白的基因和可能的启动区,共2.65kb的DNA片段,其中glnA（798bp）编码谷氨酰胺ABC转运系统中的结合蛋白,含有265个氨基酸序列,蛋白质分子量为29382;glnB（657bp）编码谷氨酰胺ABC转运系统的透性酶,含有218个氨基酸,蛋白质分子量为24474;glnC（723bp）编码编码谷氨酰胺ABC转运系统的ATP-结合蛋白,含有240个氨基酸序列,蛋白质分子量为26435。采用软件分析菌株D-8T、克劳氏芽孢杆菌（Bacillus. clausii）,Oceanobacillus. iheyensis和大肠杆菌k-12之间的氨基酸序列的同源性,发现菌株D-8T中的GlnABC转运蛋白总体上与革兰氏阳性菌同源性比革兰氏阴性菌高。通过互联网对GlnABC蛋白分别进行了氨基酸疏水性分析,发现GlnA蛋白的N端存在1个疏水区,而GlnB蛋白的N端存在4个疏水区,说明GlnA蛋白与GlnB蛋白可能是2个跨膜蛋白。比较GlnA蛋白与GlnB蛋白跨膜区的氨基酸组成,从其蛋白质二级结构分析来看,它们的跨膜区都是由α螺旋组成的。而GlnC属于可溶性蛋白,存在于细胞质中。

论文目录:

中文摘要

Abstract

缩写

第一章 绪论

1.1 本论文研究的理论和应用意义

1.2 中度嗜盐菌的概况

1.3 中度嗜盐菌的生理学特性

1.4 中度嗜盐菌的盐适应机制及分子基础研究进展

1.5 相容性溶质作用的分子机制

1.6 嗜盐微生物的生物能

1.7 中度嗜盐菌的遗传系统研究进展

1.8 中度嗜盐菌在生物技术中的应用

1.9 反向PCR克隆已知序列的侧翼序列技术

1.10 本论文的研究思路

第二章 达坂喜盐芽孢杆菌D-8~T四氢嘧啶合成途径ectABC基因的克隆及其功能鉴定

2.1 前言

2.2 材料和方法

2.3 结果

2.4 讨论

第三章 达坂喜盐芽孢杆菌D-8~T在不同盐生长条件下细胞内积累的主要相容性物质的研究

3.1 前言

3.2 材料和方法

3.3 结果

3.4 讨论

第四章 达坂喜盐芽孢杆菌D-8~T谷氨酰胺转运蛋白glnABC基因的克隆及其功能预测

4.1 前言

4.2 材料和方法

4.3 结果

4.4 讨论

结论

参考文献

致谢

发布时间: 2006-04-05

参考文献

• [1].甜菜碱和四氢嘧啶提高Pseudomonas putida KT2440耐盐性的分子机理研究[D]. 何健.南京农业大学2005
• [2].青海湖嗜盐菌多样性与四氢嘧啶的生物合成机制研究[D]. 朱德锐.华中师范大学2014

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