利用H2O2对双歧杆菌进行氧适应的研究

论文摘要

近年来,人们开始广泛使用益生菌来调节人体的肠道微生物,改善人体的健康状态。双歧杆菌因具有治疗腹泻、缓解乳糖不耐症和降低血清胆固醇等功能作用,使其在益生菌制品领域中占有重要的地位。然而双歧杆菌通常对氧气敏感,这使其在加工、包装和贮藏过程中极易产生氧中毒,进而导致其活力降低。避免双歧杆菌氧中毒的方法有很多,氧适应因其经济廉价、操作简便而倍受青睐。众所周知,将微生物暴露于非致死剂量的应激条件或逐渐增加应激剂量能够使细胞产生应激反应,进而更好地抵制致死剂量的应激。在一定条件下,活性氧的浓度超过细胞清除活性氧的能力,就会产生氧化应激。人为添加H2O2或O2-产生剂（百草枯或蓝雪醌）,或者通过向培养基中泵入纯氧增加氧分压,都可以产生氧化应激。目前已有增加基质溶氧量对双歧杆菌进行氧适应的研究,然而还没有添加H2O2或O2-产生剂来对双歧杆菌进行氧适应的研究。很多研究表明,H2O2是导致双歧杆菌氧中毒的主要原因,因此本试验主要围绕利用H2O2对双歧杆菌进行氧适应展开研究。本研究首先从7株试验用双歧杆菌中,筛选出疏水性和降胆固醇能力均高的双歧杆菌株作为试验菌株,而后通过分析试验菌株在不同浓度H2O2条件下的存活率,找到对该菌株进行氧适应的H2O2浓度,继而研究试验菌株的H2O2适应反应,最后研究H2O2适应对试验菌株几种特性的影响、对试验菌株的交叉保护,以及H2O2适应反应的遗传稳定性。本研究得到如下结果:（1）试验菌株疏水性及降胆固醇能力的分析在7株试验用双歧杆菌中,B. bifidum KLDS2.0613的疏水性和降胆固醇能力最高,分别为90.71%±3.07%和15.96±0.51μg/mL,因此接下来以B. bifidum KLDS2.0613为试验菌株进行下列研究。（2）试验菌株的H2O2适应反应适应细胞的H2O2浓度直接影响B. bifidum KLDS2.0613的H2O2适应反应。B. bifidum KLDS2.0613经3 mg/L H2O2适应后,适应菌株耐受致死剂量H2O2的能力最高可以提高大约322.05倍;而经0.3 mg/L H2O2适应后,适应菌株耐受致死剂量H2O2的能力最高仅可以提高大约5.83倍。（3）H2O2适应对试验菌株部分特性的影响3 mg/L H2O2适应不影响B. bifidum KLDS2.0613的生长特性和降胆固醇能力。然而3 mg/L H2O2适应影响了该菌株的疏水性,使其疏水性显著降低（原始菌株的疏水性为90.71±1.96%,而适应菌株的疏水性为61.88±3.24%）,但适应菌株在37℃条件下,厌氧培养18h后,其疏水性又恢复至正常水平。（4）H2O2适应对试验菌株的交叉保护B. bifidum KLDS2.0613经3 mg/L H2O2适应后可以对酸应激和热应激产生交叉保护。B.bifidum KLDS2.0613经3 mg/L H2O2适应后,其耐酸能力提高大约1.92倍,而耐热能力提高大约30.80倍。（5）H2O2适应反应的遗传稳定性B. bifidum KLDS2.0613经3 mg/L H2O2适应所产生的适应反应不能够稳定遗传。3 mg/L H2O2适应后的试验菌株在37℃条件下,厌氧培养5h后,其在120 mg/L H2O2浓度下,作用1h后的存活率下降为0.40±0.03%,与未适应菌株相当（存活率为0.23±0.13%）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 双歧杆菌的厌氧性及解决其氧中毒的方法
• 1.1.1 双歧杆菌的厌氧性
• 1.1.2 解决双歧杆菌氧中毒的方法
• 1.2 细菌的氧适应
• 1.2.1 细菌应激适应的机制
• 1.2.2 细菌氧适应的种类
• 1.2.3 细菌氧适应的交叉保护
• 1.2.4 双歧杆菌的氧适应
• 1.3 双歧杆菌的粘附
• 1.3.1 双歧杆菌粘附的意义
• 1.3.2 双歧杆菌粘附的机制
• 1.4 益生菌的降胆固醇作用
• 1.4.1 益生菌降胆固醇作用的意义
• 1.4.2 益生菌降胆固醇作用的机制
• 1.5 本研究的主要目的与意义
• 1.5.1 研究目的
• 1.5.2 研究意义
• 1.6 本研究拟采取的技术路线
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验用菌株
• 2.1.2 培养基及溶液的配制
• 2.1.3 重要试剂及来源
• 2.2 仪器与设备
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 双歧杆菌的活化与培养
• 2.3.2 双歧杆菌的平板菌落计数法
• 2.3.3 试验菌株疏水性的分析
• 2.3.4 试验菌株降胆固醇能力的分析
• 2O₂ 敏感性的分析'>2.3.5 试验菌株对不同浓度H₂O₂敏感性的分析
• 2O₂ 适应反应'>2.3.6 试验菌株的H₂O₂适应反应
• 2O₂ 适应对试验菌株部分特性的影响'>2.3.7 H₂O₂适应对试验菌株部分特性的影响
• 2O₂ 适应的交叉保护'>2.3.8 试验菌株H₂O₂适应的交叉保护
• 2O₂ 适应能力的遗传稳定性'>2.3.9 试验菌株H₂O₂适应能力的遗传稳定性
• 2.3.10 数据处理
• 3 结果与分析
• 3.1 试验菌株疏水性和降胆固醇能力的分析
• 3.1.1 七株双歧杆菌的疏水性
• 3.1.2 七株双歧杆菌的降胆固醇能力
• 3.1.3 小结
• 2O₂ 的敏感性'>3.2 试验菌株对不同浓度H₂O₂的敏感性
• 3.2.1 试验菌株的生长曲线
• 2O₂ 的敏感性'>3.2.2 试验菌株对不同浓度H₂O₂的敏感性
• 3.2.3 小结
• 2O₂ 适应反应'>3.3 试验菌株的H₂O₂适应反应
• 2O₂ 浓度下的适应反应'>3.3.1 试验菌株在0.3 mg/L H₂O₂浓度下的适应反应
• 2O₂ 浓度下的适应反应'>3.3.2 试验菌株在3 mg/L H₂O₂浓度下的适应反应
• 3.3.3 小结
• 2O₂ 适应对试验菌株部分特性的影响'>3.4 H₂O₂适应对试验菌株部分特性的影响
• 2O₂ 适应对试验菌株生长特性的影响'>3.4.1 H₂O₂适应对试验菌株生长特性的影响
• 2O₂ 适应对试验菌株疏水性的影响'>3.4.2 H₂O₂适应对试验菌株疏水性的影响
• 2O₂ 适应对试验菌株降胆固醇能力的影响'>3.4.3 H₂O₂适应对试验菌株降胆固醇能力的影响
• 3.4.4 小结
• 2O₂ 适应的交叉保护'>3.5 试验菌株H₂O₂适应的交叉保护
• 2O₂ 适应对试验菌株酸耐受性的影响'>3.5.1 H₂O₂适应对试验菌株酸耐受性的影响
• 2O₂ 适应对试验菌株热耐受性的影响'>3.5.2 H₂O₂适应对试验菌株热耐受性的影响
• 3.5.3 小结
• 2O₂ 适应能力的遗传稳定性'>3.6 试验菌株H₂O₂适应能力的遗传稳定性
• 4 讨论
• 4.1 双歧杆菌的疏水性和降胆固醇能力
• 4.1.1 双歧杆菌的疏水性
• 4.1.2 双歧杆菌的降固醇能力
• 2O₂ 的敏感性'>4.2 双歧杆菌对H₂O₂的敏感性
• 2O₂ 适应反应'>4.3 双歧杆菌的H₂O₂适应反应
• 2O₂ 适应对双歧杆菌的影响'>4.4 H₂O₂适应对双歧杆菌的影响
• 2O₂ 适应对双歧杆菌生长特性的影响'>4.4.1 H₂O₂适应对双歧杆菌生长特性的影响
• 2O₂ 适应对双歧杆菌疏水性的影响'>4.4.2 H₂O₂适应对双歧杆菌疏水性的影响
• 2O₂ 适应对双歧杆菌降胆固醇能力的影响'>4.4.3 H₂O₂适应对双歧杆菌降胆固醇能力的影响
• 2O₂ 适应的交叉保护'>4.5 双歧杆菌H₂O₂适应的交叉保护
• 2O₂ 适应对试验菌株酸耐受性的影响'>4.5.1 H₂O₂适应对试验菌株酸耐受性的影响
• 2O₂ 适应对试验菌株热耐受性的影响'>4.5.2 H₂O₂适应对试验菌株热耐受性的影响
• 2O₂ 适应能力的遗传稳定性'>4.6 双歧杆菌H₂O₂适应能力的遗传稳定性
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读学位期间发表的学术论文