论文摘要
目的和意义:多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是血液系统常见的恶性肿瘤,虽然迄今为止仍然难以治愈,但是近年来出现的一些新的靶向治疗药物在部分MM尤其是对常规化疗药物耐药的患者中取得了令人满意的疗效。其中蛋白酶体抑制剂（PI）硼替佐米由于其对骨髓瘤细胞的高度特异性杀伤性及其相对较轻的副作用已经广泛地应用于临床,并且也显示了可喜的疗效。众所周知,硼替佐米通过特异性地抑制26S蛋白酶体对IκB的降解,进而阻断了NF-κB的激活而发挥抗骨髓瘤活性。但这是否能完全解释PI高度选择性的抗骨髓瘤活性呢?先前有学者报道蛋白酶体抑制剂（硼替佐米）与直接抑制NF-κB的药物（包括特异性IκB激酶抑制剂PS-1145或不可逆的IκBα磷酸化抑制剂BAY11-7082）相比,具有更显著的抗骨髓瘤细胞增殖的能力。这提示我们蛋白酶体抑制剂选择性的抗骨髓瘤增殖效应不单纯是抑制NF-κB的结果,其中一定还有其它的机制在发挥作用。MM细胞与正常的浆细胞一样,产生大量的需要内质网（ER）处理的分泌性免疫球蛋白,这些免疫球蛋白的合成过程中必然伴随着错误折叠蛋白的出现,包括有缺陷的核糖体产物等需要泛素—蛋白酶体系统的降解。如果蛋白酶体的功能受到抑制必然影响内质网相关的降解（ERAD）,影响了错误折叠蛋白由ER腔向胞质的逆向转运（retrograde translocation）,造成错误折叠蛋白在ER腔的累积引发ER应激（ERS）并激活未折叠蛋白反应（UPR）,而持续或过度UPR,就可以导致细胞的凋亡。因此MM细胞必定对于PI引发的ERAD受阻异常敏感。先前也有报道联合应用PI与增加ER压力的药物如衣霉素（Tunicamycin）具有明显的协同作用,可显著增强对骨髓瘤细胞的杀伤效应,这也从侧面提示PI对骨髓瘤细胞的杀伤效应可能与UPR密切相关。但是蛋白酶体抑制剂究竟是如何影响MM细胞中的UPR还需要进一步深入的研究。另外一个靶向治疗药物2-甲氧基雌二醇（2-methoxyestradiol,2ME2）为雌二醇的生理代谢产物,具有抗多种肿瘤的活性,目前已应用于临床Ⅱ期试验中。我们先前实验研究发现低剂量2ME2（0.1μmol/L-0.5μmol/L）可诱导骨髓瘤细胞向成熟阶段分化,表现为细胞向成熟浆细胞形态的转变,细胞表面分化抗原CD49e的表达上调,分泌的免疫球蛋白也增多。已有研究证实UPR在B细胞向浆细胞分化过程当中发挥着重要作用,保证只有正确折叠的抗体才能由浆细胞内分泌出来。转录因子XBP-1通过UPR途径介导B细胞向浆细胞分化。我们发现2ME2诱导骨髓瘤细胞分化的过程中,XBP-1的确是上调的,并且是由其上游调控基因PRDM1的上调解除了转录因子Pax—5对XBP-1的抑制实现的,提示PRDM1——浆细胞分化阶段的主要转录调控因子在UPR中也发挥着重要作用。最近学者Doody等也提出PRDM1也是UPR的靶基因之一,B细胞中UPR激活后PRDM1mRNA表达水平迅速上调。PRDM1为PRDM基因家族成员,该家族在肿瘤发生中存在着特殊的阴阳作用机制,即包含或缺失PR结构域的两种同源异构体分别发挥抑癌基因和癌基因的作用。那么在2ME2诱导骨髓瘤细胞分化的过程中对PRDM1两种同源异构体（包含PR结构域的PRDM1α和缺失PR结构域的PRDM1β）表达的影响如何及其是否能够与阴阳作用机制相吻合就需要进一步研究。研究方法和结果:一、以三个MM细胞系KM3、RPMI-8226和NCI-H929作为研究对象,我们首先采用MTT法检测BZ作用后的细胞活力,计算各个细胞系的IC50浓度。然后分别采用荧光实时定量PCR及Western-blot方法,对在UPR中发挥重要作用的靶基因GRP78/BiP和XBP-1两种同源异构体（XBP-1u、XBP-1s）在硼替佐米作用不同时相（0h、4h、12h、24h）的表达情况进行检测。结果发现不同的骨髓瘤细胞系对BZ敏感性差异显著,KM3、RPMI8226和NCI-H929的IC50分别为420.3073nM、129.083nM和70.913nM。荧光实时定量PCR结果显示三个MM细胞系中,BiP-mRNA水平均随作用时间逐渐上升,12h达到高峰,在KM3、RPMI8226和NCI-H929中分别由0.209±0.024上升至0.350±0.015（p＜0.05）、0.365±0.124上升至2.175±0.175（p＜0.05）、0.324±0.016上升至2.235±0.355（p＜0.05）,BiP-mRNA表达水平在BZ作用后显著上升。BiP蛋白表达水平亦均随作用时间逐渐上升,24h达到高峰,在KM3、RPMI8226和NCI-H929中BiP蛋白表达量分别为基础表达量的0.92～1.73、1.46～2.68、1.17～1.80倍,但差异不显著。BZ处理后4hXBP-1u-mRNA即明显增加,而XBP-1s mRNA则显著下降;对XBP-1u/XBP-1s比值进行了标化,结果发现BZ处理后4h XBP-1u/XBP-1s比值显著上升,在KM3、RPMI8226和NCI-H929中分别由基础比值1.22±0.04上升至8.17±2.03（p＜0.05）、5.64±2.00上升至34.23±10.03（p＜0.05）、3.10±0.24上升至7.56±1.76（p＜0.05）。Western-blot结果显示BZ处理前后XBP-1总蛋白表达水平无显著变化,在KM3、RPMI8226和NCI-H929中XBP-1总蛋白表达量分别为基础表达量的0.76～1.23、0.77～1.43、0.70～1.41倍。二、以人MM细胞系NCI-H929、RPMI8226、KM3和LP-1作为研究对象,采用实时定量PCR方法检测低剂量（终浓度0.5μmol/L）作用48h和72h时PRDM1α和PRDM1β的表达情况。结果发现低剂量2ME2处理后,在4个骨髓瘤细胞系中均出现PRDM1基因表达上调,通过与内参GAPDH的拷贝数进行标化,发现两种同源异构体的表达水平随着2ME2的作用时间均有不同程度的增加,并且α/β比值随着2ME2的作用时间显著上升,在NCI-H929、RPMI8226、KM3和LP-1中分别由基础比值1.461±0.033上升至作用72h时的2.663±0.381（p＜0.01）、1.929±0.334上升至2.727±0.362（p＜0.05）、1.471±0.012上升至4.367±0.243（p＜0.001）、1.660±0.042上升至3.059±0.167（p＜0.001）。结论:一、不同的骨髓瘤细胞系对BZ敏感性不同,MM细胞内产生的需要ER处理的分泌性免疫球蛋白愈多,对于PI造成的ERAD受阻就越敏感,细胞内UPR程度就愈高,就更易于发生凋亡,细胞内错误折叠蛋白量与其对PI的敏感性成正相关。对于不分泌型MM细胞,上述机制不发挥作用,对于BZ的敏感性较差。二、分子伴侣（Chaperon）作为细胞保护性的UPR蛋白,在UPR激活时转录、翻译水平增加,帮助未折叠或错误折叠蛋白正确地折叠与组装。BZ通过阻断UPR中的ERAD提高MM细胞内ER压力,激活了UPR,但BZ增加MM细胞内ER压力的同时分子伴侣的表达量仅略微上升,与基础表达水平并无显著差异。浆细胞作为专业性分泌细胞,ER固有的伴侣分子的组成性高表达是其特征,是其发挥正确地组装、分泌免疫球蛋白这些生理功能所必需的。浆细胞内细胞保护性的UPR蛋白——伴侣分子的表达量可能已经接近最大化,因此任何额外的ERS并不能使其进一步显著增加。三、XBP-1是UPR的关键靶基因,PI不但可以从源头上阻止具有转录活性的XBP-1s的产生,而且可以通过稳定XBP-1u蛋白来负性调节XBP-1s的功能。XBP-1激活后其下游靶基因如伴侣分子等对细胞具有保护作用,PI通过抑制XBP-1激活阻止UPR对肿瘤细胞的保护作用。四、PI一方面通过抑制ERAD增加了恶性浆细胞内的ERS,激活了UPR;另一方面通过抑制XBP-1的激活阻止UPR中对细胞生存有利的下游靶基因的激活,解除了UPR对细胞保护的一面,使细胞内UPR程度升高激活凋亡通路。这可能是除了抑制NF-κB以外PI发挥抗骨髓瘤活性的另一个重要机制。五、低剂量2ME2诱导骨髓瘤细胞发生分化的同时,同时上调PRDM1α和PRDM1β的表达,但是具有潜在抑癌作用的PRDM1α上调程度更加显著,因而PRDM1α/PRDM1β比值随着2ME2的作用时间显著上升,与细胞分化程度呈正相关,与PRDM家族的阴阳作用机制相符合。