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离子束诱变环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株选育

2020-11-23阅读(81)

离子束诱变环糊精葡萄糖基转移酶高产菌株选育

论文摘要

环糊精葡萄糖基转移酶（cyclodextrin glycosyltransferase，CGTase）及β-环糊精（β-cyclodextrin，β-CD）具有较大的应用价值。工业用CGTase均由微生物发酵产生，而β-CD是应用CGTase转化淀粉进行生产。我国CGTase及β-CD的生产虽有20多年的历史，由于生产菌种发酵产酶水平较低，CGTase及β-CD的生产成本过高导致市场价格偏高而使其应用受到一定的限制。 目前国内厂家生产菌种发酵30～40h，产酶水平为2000～4000 IU／mL。CGTase的生产成本约占β-CD整个生产成本的一半。应用离子束注入诱变技术对CGTase产生菌进行诱变，选育高产菌株，并研究高产菌株发酵产酶的最适发酵条件，以降低CGTase和β-CD的生产成本。 经过能量30keV、剂量范围1×1014～1×1016ions／cm2的氮离子注入诱变选育，得到产酶水平是出发菌株1.62倍的高产菌株B．sp．HA-1，该菌株经中科院微生物保藏中心鉴定为一新菌株。 经过发酵条件的优化，得到两个适宜的培养基配方和最佳培养条件。配方Ⅰ为糊精2％、玉米浆5％、k2HPO40.2％、（NH4）2SO40.02％；配方Ⅱ为玉米粉2％、玉米浆5％、k2HPO40.2％、MgSO4 0.02％。在培养基起始pH8～9，温度28℃的培养条件下发酵酶活力最高，增加接种量可以缩短发酵周期。应用配方Ⅰ，以10％接种量接种，在最佳培养条件下，高产菌株B．sp．HA-1摇瓶发酵24h产酶水平在6000IU／mL左右，40h产酶在7000IU／mL以上，最高达到8000IU／mL。 研究了高产菌株B．sp．HA-1产酶的传代稳定性。连续传20代，F2～F20代产酶水平是F1代的98.11％～102.66％，表明该菌株产酶具有良好的传代稳定性。 比较高产菌株和出发菌株产生的CGTase，发现两者之间的分子量或比活力均没有差异，认为诱变后菌株产酶水平的提高可能与CGTase基因的转录与表达增强有关。 对产自B．sp．HA-1菌株的CGTase进行纯化和酶学性质研究，结果表明该酶的分子量为71.9KDa；在60℃活力最高，55℃以下稳定性好，65℃的半衰期约为1h；在pH5～6时活力最高，pH5～11范围内较为稳定；金属离子Zn2+、Ag+、Hg2+、Cu2+、Fe2+、Al3+对CGTase的活性具有抑制作用。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 目录
  • 引言
  • 第一章 文献综述
  • 1.1 微生物诱变育种方法简介
  • 1.2 离子束生物工程的研究及应用现状
  • 1.3 环糊精葡萄糖基转移酶的研究概况
  • 1.4 β-环糊精的研究进展
  • 第二章 材料与方法
  • 2.1 菌种
  • 2.2 主要原料与试剂
  • 2.3 主要仪器与设备
  • 2.4 培养基
  • 2.5 实验方法
  • 2.5.1 样品处理及离子束诱变
  • 2.5.2 筛选方法
  • 2.5.3 酶活力测定
  • 2.5.4 β-CD的测定
  • 2.5.5 传代方法
  • 2.5.6 蛋白质测定方法
  • 2.5.7 菌体生长测定方法
  • 第三章 氮离子注入诱变CGTase高产菌株的选育
  • 3.1 出发菌株基本情况
  • 3.2 高产菌株的选育与鉴定
  • 3.3 高产菌株稳定性研究
  • 3.4 出发菌株与高产菌株的比较
  • 3.4.1 产酶水平的比较
  • 3.4.2 酶产物的比较
  • 3.4.3 酶比活力的比较
  • 3.5 小结与讨论
  • 第四章 高产菌株摇瓶发酵条件的研究
  • 4.1 碳源对发酵产酶的影响
  • 4.2 氮源对发酵产酶的影响
  • 4.3 无机盐对发酵产酶的影响
  • 4.4 培养基组分优化组合
  • 4.5 碳氮源不同浓度配比对发酵产酶的影响
  • 4.6 起始pH对发酵产酶的影响
  • 4.7 温度对发酵产酶的影响
  • 4.8 接种量对发酵产酶的影响
  • 4.9 装瓶量对发酵产酶的影响
  • 4.10 小结与讨论
  • 第五章 环糊精葡萄糖基转移酶酶学性质研究
  • 5.1 CGTase的纯化
  • 5.2 CGTase的光谱学性质
  • 5.3 温度对CGTase活性和稳定性的影响
  • 5.4 pH对CGTase活性和稳定性的影响
  • 5.5 金属离子对CGTase活性和稳定性的影响
  • 5.6 CGTase转化淀粉生成β-CD的研究
  • 5.6.1 转化底物的选择
  • 5.6.2 底物浓度
  • 5.6.3 转化温度
  • 5.6.4 转化pH
  • 5.6.5 有机溶剂对转化率的影响
  • 5.7 小结与讨论
  • 第六章 高产菌株发酵规律及生产工艺研究
  • 6.1 高产菌株摇瓶培养最佳种龄
  • 6.2 高产菌株发酵规律的研究
  • 6.3 高产菌株发酵工艺优化
  • 6.3.1 提高搅拌转速对菌体发酵产酶的影响
  • 6.3.2 提高搅拌转速和直接通氧对菌体发酵产酶的影响
  • 6.4 应用高产菌株进行CGTase和β-CD的生产研究
  • 6.4.1 CGTase生产条件优化
  • 6.4.2 高产菌株原料适应性试验
  • 6.4.3 CGTase的工业化生产
  • 6.4.4 β-CD的工业化生产
  • 6.5 小结与讨论
  • 总结
  • 参考文献
  • 附录
  • 致谢

    • 相关论文文献

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