低浓度反式7，8-二羟-9，10环氧苯并（a）芘诱发人羊膜细胞分泌蛋白谱改变的研究

论文摘要

苯并（a）芘（B[α]P）是一种在环境中广泛存在的污染物，主要产生于烟草燃烧，汽车尾气以及油炸熏烤食品，并且具有强烈的致癌性。B[α]P主要通过细胞色素P450酶系代谢，代谢产物多达30余种，而其中反式7，8-二羟-9，10环氧苯并（a）芘（反式BPDE）能够引起DNA的加合物形成和氧化损伤，被认为是致突变和致癌性最强的一种。DNA加合物的形成会诱导一系列的细胞应答反应，如信号通路的激活，细胞凋亡，细胞周期停顿，DNA修复，跨损伤DNA合成等等。当细胞暴露于BPDE后，一些与凋亡相关的信号蛋白如MAPK家族的JNK和p38，以及参与调控凋亡相关基因转录过程的一些蛋白如p53蛋白均被激活。但同时，细胞内的Ca2+浓度上调，Ras／Erk／AP-1，以及PI-3k／Akt等与抗凋亡和肿瘤发生密切相关信号通路也被激活，这些证据揭示了BPDE所诱发细胞应答的复杂性。BPDE还可以引起细胞周期的停顿。比如它可以使得Chk1发生磷酸化而被激活，而后者可以介导DNA加合物形成所引起的细胞周期S期的校正。p53蛋白是它的重要底物，p53的激活可以进一步激活p21，并因此抑制驱动细胞周期向前进展的CDK的活性。最终细胞的DNA合成被延迟或者阻断，随着BPDE剂量的增加甚至还表现为DNA复制的起始和延伸阶段的抑制。BPDE-DNA加合物如果未被正确修复，则会导致跨损伤DNA合成的发生。参与跨损伤合成DNA聚合酶与正常复制时的DNA聚合酶有所不同，它们的保真度往往比较低，因此使得基因突变更容易发生。p53基因和K-ras原癌基因是吸烟相关肺癌中最常发生突变的两个基因。研究发现，这两个基因的突变热点和BPDE-DNA加合物形成的位点之间具有高度的一致性，这为BPDE引起致癌和抑癌基因的突变，进而诱导肿瘤的发生提供了有力的证据。此外，BPDE尚可在染色体易碎位点（fragile site）引起染色体异常。本实验室正在进行的BPDE诱发细胞应答的全基因组和蛋白质组学分析的初步结果显示，总计有多达几百个基因和蛋白质的表达在BPDE处理后发生了改变，这些基因／蛋白质涉及到极为广泛的细胞功能，包括转录，翻译，细胞周期调控，信号通路激活，细胞代谢和解毒等等，提示了BPDE对整个细胞应激网络作用的复杂性和多样性。作为一种已被确认的环境致癌物，BPDE暴露的人群监测对于环境危险度的评价，尤其是对那些特殊职业暴露者和有健康危险行为的人来，说无疑具有非常重要的意义。而这种监测则依赖于一些敏感性和特异性均较好的生物标志物。生物标志物是一些可以测量的指标，用来表征特定的生物状态，特别是那些具有致病危险性的反应，疾病的发生及其所处的不同阶段。它们已经被广泛地运用于疾病的早期诊断、疾病的亚型分类、疾病的进展检测、疾病的治疗效果和预后的评估以及人群健康检测等各个方面。而蛋白质作为细胞各项功能的最终执行者，同时也是最常见的疾病攻击／治疗靶点，是最为理想的生物标志物，也一直是研究的热点。目前，蛋白质组学分析已经成为了筛选生物标志物的主流策略，因为它能够从整体上来分析蛋白质表达谱的改变，并进行后续鉴定，具有以往低通量技术如免疫印迹法等无可比拟的高效性。而从临床和人群监测的实际性考虑，那些用来检测的标本往往是通过无创性的手段获得的，比如血液，唾液，尿液等等，因而最理想的生物标志物应当是由细胞分泌或者渗漏到这些体液中的蛋白质。但在血液等标本中，作为生物标志物的分泌蛋白往往已经被大大地稀释了，从而被那些高丰度的组成性蛋白（如血清白蛋白）所掩盖而无法得到效检测。因此，在本研究中，我们收集了培养细胞的上清作为体液的一种较好的替代，来避免高丰度蛋白的干扰，并用双向凝胶电泳（2-DE）和基质辅助激光解吸—飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）来分析BPDE处理的细胞和对照组细胞间的差异分泌组，寻找潜在的生物标志物。我们用5纳摩尔／升的反式BPDE处理人羊膜上皮细胞，并用二甲亚砜作为溶剂对照，在经过相应的处理步骤之后，各组的培养上清均被收集，经过离心超滤，冷丙酮沉淀后，冻干的蛋白样品被重悬于裂解缓冲液，继而用Bradford法测定蛋白浓度。等量的各组样品经重泡胀而被IPG胶条（pH 4-7线性，24厘米）吸收后进行第一向的等电聚焦。第二向的十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）在含12.5％SDS的凝胶上进行。电泳后的凝胶经过银染显色后进行扫描，所得的图像用PDQuest图像分析软件4．7．0版进行定量分析并建立差异分泌蛋白谱。有3个蛋白点只在BPDE处理组的上清中出现，另有16个蛋白点的相对量（即该蛋白点的量／所有检测到的所有蛋白点的量）在BPDE处理后较之对照组有所上调（p＜0.05）。上述差异表达的蛋白点被从胶上切取，经脱色后进行胶内胰酶消化。消化后所得的肽段混合物用MALDI-TOF MS分析获得相应的肽指纹谱。所得的肽指纹谱提交在线分析工具MASCOT，并在NCBI非冗余蛋白序列数据库中进行肽指纹谱的匹配。共有12个蛋白点成功地与数据库中的相关蛋白匹配而得到鉴定，包括一个新出现的点——14-3-3ζ蛋白，和若干个处理后上调的点，如annexin V，annexin A3和羟基丙酮酸盐异构酶同系物等。与此形成对照的是，14-3-3ζ蛋白和annexin A3在对BPDE处理细胞的胞内差异蛋白质组学的分析中却表现为下调。上述蛋白质参与了许多细胞功能的调控，有些还与肿瘤发生具有一定的相关性，但具体的机制还远不够明确。综上所述，双向电泳—质谱鉴定的蛋白质组学方法是一种非常有效的筛选生物标志物的策略，而对BPDE处理细胞和对照细胞间的差异分泌蛋白谱的研究从细胞分泌的角度揭示了BPDE诱发的细胞应答网络的复杂性，同时也初步筛选出了相应的潜在生物标志物，以供进一步的研究。

论文目录

• Abbreviations
• Abstract
• Abstract in Chinese
• Introduction
• Materials
• Methods
• Results
• Discussion
• Conclusion
• References
• Review
• Acknowledgement