论文摘要
特发性血小板减少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP）是临床最为常见的出血性、自身免疫性疾病,约占出血性疾病总数的30%。以外周血小板减少、骨髓巨核细胞正常或增多伴成熟障碍为主要表现。目前,治疗以长期使用肾上腺皮质激素、免疫抑制剂及脾切除等方法为主,容易引发感染、骨髓抑制等,并且约有1/3的患者上述治疗无效,迁延不愈,甚至危及生命。本病发病机制复杂,至今尚未完全阐明。长期以来由自身抗体介导的血小板破坏增多被看成是ITP的主要病因。即血小板膜表面糖蛋白（glycoprotein,GP）作为自身抗原,特别是GPⅡb/Ⅲa和GPⅠb/Ⅸ复合物,刺激机体免疫系统产生特异性自身抗体,通过其Fab段与自身抗原结合,致敏的血小板容易被机体的网状内皮系统所清除,特别是脾脏中的单核吞噬细胞吞噬破坏,从而导致血小板减少。但是ITP发病具有明显的异质性。随着研究的深入,体液免疫异常在ITP发病过程中起决定性作用的观点已日益受到挑战。由于血小板自身抗体只能在50%-70%ITP患者中检测到,并且阴性结果不能排除诊断。多数研究认为ITP患者呈Th1优势反应模式,而Th1优势反应除可促进抗体产生外,还能直接促进淋巴细胞的细胞毒作用。因此,近年来细胞免疫功能失调在ITP发病中的作用越来越受重视。研究发现ITP患者外周血CD8+细胞增多,CD4+/CD8+下降。Olsson等应用基因芯片技术发现在ITP患者与细胞毒作用有关的基因以及与Th1细胞反应有关的基因表达增高,提示细胞介导的细胞毒作用可能在ITP发病中起重要作用。随后,Olsson等和张峰等的体外实验证实细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocyte,CTL,CD8+T）能直接参与对ITP患者血小板的杀伤,导致血小板持续破坏。目前普遍认为,除血小板破坏增多外,血小板生成减少也参与ITP的发病。血小板动力学研究及骨髓巨核细胞形态学检查均证实ITP患者的血小板生成减少。既然巨核细胞表面亦表达GPⅡb/Ⅲa和GPⅠb/Ⅸ,血小板自身抗体同样可以作用于巨核细胞,影响巨核细胞生成或导致巨核细胞在骨髓内被活化的补体或吞噬细胞破坏。多项研究证实,纯化的血小板膜糖蛋白抗体能够抑制巨核细胞集落的增殖,进而影响血小板生成。Chang等和McMillan等发现ITP患者血浆和纯化的血小板自身抗体可抑制体外巨核细胞生长,导致巨核细胞数量明显降低。充分证明血小板特异性抗原的自身抗体不仅介导外周血小板破坏,还影响骨髓中巨核细胞的生长和发育成熟。但是多数ITP患者骨髓中巨核细胞数量正常或增多,其血小板生成减少不能用巨核细胞数量降低解释。血小板生成与成熟巨核细胞的凋亡密切相关,巨核细胞凋亡异常即会引起血小板生成障碍。对ITP患者骨髓巨核细胞超微结构的研究表明,患者的巨核细胞存在广泛的异常,这些异常的巨核细胞发生与凋亡相似但不同于凋亡的程序性细胞死亡,是导致血小板生成减少的重要原因。我们首先应用改良MAIPA技术检测ITP患者血浆中的特异性血小板膜糖蛋白（GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ）自身抗体水平,以双色流式细胞技术为基础的细胞毒实验技术检测ITP患者及正常对照CTL对自身血小板的杀伤效应,比较MAIPA阳性和阴性ITP患者CTL对自体血小板的杀伤及地塞米松的作用。我们还将ITP患者血浆及其组分与正常脐血CD34+细胞共同孵育,定向扩增巨核细胞,观察ITP血浆及其组分对巨核细胞和血小板形成的影响。第一部分细胞毒作用在ITP发病及地塞米松治疗中的意义研究目的:比较MAIPA阳性和阴性ITP患者细胞毒T淋巴细胞对自体血小板的杀伤及地塞米松的作用,分析自身细胞毒杀伤血小板与抗血小板自身抗体的关系。方法:*抽取48例ITP患者和17例正常人的外周血15ml,其中患者标本分别在大剂量地塞米松治疗前和治疗后两周采样。*改良MAIPA检测ITP患者血浆中抗GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ自身抗体。*从外周血中分离单个核细胞和血小板。*用免疫磁珠分离技术分离CD8+细胞。*以自身血小板为靶细胞,以CD8+细胞为效应细胞的细胞毒实验。*用CD41a和Annexin V标记血小板,流式细胞仪分析被Annexin V标记的血小板比例（血小板裂解率）,以间接反映效应细胞的杀伤能力。*在ITP患者MAIPA阳性组与阴性组间进行细胞毒作用的比较。结果:*经改良MAIPA技术检测,48例慢性ITP患者血浆中,22例（MAIPA阳性组）一种以上抗体阳性,26例（MAIPA阴性组）抗体阴性。*大剂量地塞米松治疗前,ITP患者两组的血小板裂解率均明显高于正常对照组（P＜0.05）。ITP患者MAIPA阴性组血小板裂解率明显高于MAIPA阳性组,两者差异有显著性（P＜0.05）。*大剂量地塞米松治疗前,在ITP患者MAIPA阴性组,血小板计数和血小板裂解率呈负性相关（r=-0.439,P＜0.05）;而在MAIPA阳性组两者无显著相关性（r=-0.322,NS）。*大剂量地塞米松治疗后,ITP患者两组的血小板裂解率均明显低于治疗前（P＜0.05）。结论:*证实了细胞介导的细胞毒作用参与了ITP患者血小板破坏,而且在检测不到抗GPⅡb/Ⅲa、Ⅰb/Ⅸ抗体的ITP患者发病中发挥更大作用。*地塞米松可能有抑制CTL介导的细胞毒杀伤血小板作用。保护自身血小板免受细胞介导的细胞毒作用是HD-DXM发挥治疗作用的机制之一。*干预CTL介导的血小板破坏可能成为ITP治疗的一个新靶点第二部分ITP患者血浆对体外巨核细胞和血小板形成的影响及机制探讨目的:研究ITP血浆及其组分对正常脐血CD34+细胞定向扩增巨核细胞和血小板形成的影响。方法:*留取49例ITP患者和22例正常人的外周血血浆。*用免疫磁珠分离技术分离脐血CD34+细胞。*亲和层析法提取ITP患者和正常对照血浆IgG。* ITP患者血浆的自身抗体吸附。* CD34+细胞与ITP患者或正常对照血浆、IgG、自身抗体吸附后血浆共同孵育,定向扩增巨核细胞。*流式细胞仪检测CD41a的表达。*检测培养体系中生成的血小板。* CD41a+细胞DNA倍体分析。* CD41a+细胞凋亡检测。* CD41a+细胞Bcl-xL检测。*流式细胞仪检测CD41a+细胞的周期蛋白B1或周期蛋白D3的表达。结果:*ITP患者血浆、IgG、自身抗体吸附后血浆对巨核细胞生成的影响。平行检测49例ITP患者血浆、IgG、非IgG对巨核细胞生成的影响。培养第15天时,26例ITP患者血浆孵育下的CD41a+细胞数＞正常血浆孵育组的（?）+1s[（5.10+0.90）×105],定义为A组;14例ITP患者血浆孵育下的CD41a+细胞数＜正常血浆孵育组的（?）-1s[5.10—0.90)×105],定义为B组;余9例介于正常血浆孵育组（?）-1s与x+1s之间,定义为C组。IgG作用下的A组[（3.15±0.93）×105]和B组[（3.02±1.01）×105]的巨核细胞生成,显著低于C组[（4.57±0.78）×105]和正常对照组[（4.90±0.48）×105]（P＜0.05）。ITP患者血浆自身抗体吸附后,A组[（7.85±1.30）×105]的巨核细胞数量升至甚至超过正常对照水平[（5.36±0.58）×105]（P＜0.05）。*多数患者ITP血浆促使巨核细胞生成增加,但成熟障碍和血小板生成减少,且抑制凋亡。A组[16.35%±4.90%,（7.51±2.41）×103]和B组[16.110%±5.66%,（7.21±2.45）×103]的多倍体和血小板计数,均显著低于正常对照[24.57%±2.83%,（11.21±1.82）×103]和C组[24.66%±2.49%,（10.12±1.91）×103]（P＜0.05）。并且A组[21.88%±3.53%]的巨核细胞凋亡比B组[27.36%±4.31%]、C组[28.21%±4.02%]和正常对照[29.43%±3.80%]显著受抑（P＜0.05）。同时,A组血浆作用下的巨核细胞Bcl-xl高表达。*多数ITP患者的IgG抑制巨核细胞生成,且成熟障碍和血小板生成减少,但不影响凋亡。A组[14.12%±6.09%,（5.95±2.27）×103]和B组[15.68%±5.98%,（6.15±2.37）×103]的倍体分布和血小板释放,显著低于C组[23.14%±2.27%,（9.85±1.61）×103]和正常对照组[23.98%±2.23%,（10.97±1.92）×103]（P＜0.05）。组A[28.63±4.32]、B[29.42±4.72]和C[29.30±5.55]的巨核细胞凋亡,与正常对照[30.93±3.86]无显著差别。* ITP患者的IgG作用下的巨核细胞周期蛋白B1/D3表达异常。周期蛋白D3在正常对照组培养第9天出现低水平表达（3.5%）,而ITP患者IgG组在培养第12天仍无表达。周期蛋白B1在正常对照组培养第9天出现表达降低的现象（第5天44.3%,第9天21.6%）,而ITP患者IgG组表达量较正常对照低并且未出现表达降低的现象（第5天21.4%,第9天20.5%）。*多数ITP患者的自身抗体吸附后血浆促使巨核细胞生成,无成熟障碍和血小板生成减少,但抑制凋亡。A组[22.30%±2.86%,（9.77±2.28）×103]的倍体分布和血小板释放升至甚至超过正常对照水平[23.42%±2.17%,（10.28±2.76）×103]（P＜0.05）。而与B组[30.24%±3.71%]、C组[30.08%±3.83%]和正常对照[30.73%±3.99%]比较,A组[22.44%±3.56%]的巨核细胞凋亡显著受抑（P＜0.05）。结论:*部分ITP患者的IgG可能在体外抑制巨核细胞生成并使周期蛋白B1/D3异常表达而使巨核细胞成熟障碍。*巨核细胞凋亡减少可使巨核细胞形成受抑及血小板生成减少,提示巨核细胞凋亡异常参与ITP发病。
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