论文摘要
1、致鹅卵黄性腹膜炎性大肠杆菌的分离鉴定对临床鹅卵黄性腹膜炎病例进行了细菌分离,染色镜检、形态观察、糖发酵试验、IMViC试验、TSI斜面接种试验和O抗原血清凝集试验等传统细菌分类鉴定,在此基础上扩增了E0238、E0239、E0240三个菌株的16S rDNA,通过测序和序列分析,证明获得的7株细菌为大肠杆菌,编号为E0238、E0239、E0240、E0453、E0454、E0241、E0245,其血清型分别为O2、O21、O37、O1、O24、O24、O148。2、致鹅卵黄性腹膜炎性大肠杆菌毒力相关基因检测根据网上已经公布的大肠杆菌毒力相关基因的序列,设计引物,以致鹅卵黄性腹膜炎性大肠杆菌E0238、E0239、E0240为试验对象,用PCR方法检测其毒力相关基因。试验结果显示,所检测的11个毒力相关基因中,三株致鹅卵黄性腹膜炎性大肠杆菌的fimC基因均为阳性,且均未检测到hlyE和tsh基因,其中E0239（血清型O21）具有九种毒力基因（fimC-papC-fyuA-irp2-aer-iss-colV-vat-stx2f）,而E0238（血清型O2）、E0240（血清型O37）两株细菌只检测到了fimC基因的存在。提示I型菌毛等基因可能与致鹅卵黄性腹膜炎有一定关系。3、致鹅卵黄性腹膜炎性大肠杆菌I型菌毛fimFGH基因的序列分析根据Genbank公布的fimFGH序列设计引物,对3株致鹅卵黄性腹膜炎性大肠杆菌E0238、E0239、E0240的I型菌毛fimFGH基因进行了PCR扩增、克隆和测序。序列分析结果表明,fimF、fimG、fimH基因及其所编码蛋白与Genbank中相关序列的同源性很高（同源性> 96%）,其中以基因fimH及其编码蛋白的保守性最高（同源性> 98%）,部分达到100%。研究发现FimH蛋白的主要变异集中分布在FimH粘附素N末端的4个氨基酸位点（N91S99→S91N99或N91N99;A48→V48;N156→K156即成熟FimH蛋白的N70S78→S70N78或S70N78;A27→V27;N135→K135）,本研究中在这4个氨基酸位点中仅有E0239菌株发生了变异（A48→V48即成熟蛋白A27→V27）;FimF、FimG蛋白各有一个多变区域,分别位于111～124位氨基酸位点之间和4～16位氨基酸位点之间,其中E0238、E0239菌株FimF蛋白发生了A111→S111的变异,E0238、E0240菌株FimG蛋发生了C4V9→R4L9的变异,但其变异的具体意义需更进一步研究证实。4、致鹅卵黄性腹膜炎性大肠杆菌菌体特异性蛋白的初步鉴定分别对致鹅卵黄性腹膜炎性大肠杆菌E0238、E0239、E0240进行细菌培养,将其悬浮于灭菌生理盐水制成细菌悬液（108个细菌/ml）,1.5‰甲醛灭活后离心后将菌体重悬于灭菌生理盐水并分别取0.1ml并与等体积佐剂充分混合后,分别腹腔接种免疫不同的ICR小鼠,加强免疫3次,最后一次免疫不加佐剂,免疫间隔时间为12-14天,最后一次免疫后12天分离抗血清。然后与同血清型的鸡源大肠杆菌菌体裂解物共温育,去除交叉反应性抗体,通过SDS-PAGE和Western blotting分析和鉴定致鹅卵黄性腹膜炎性大肠杆菌菌体特异性抗原。研究结果显示,致鹅卵黄性腹膜炎性大肠杆菌E0238（血清型为O2）、E0239（血清型为O21）存在一个差异性表达的蛋白,大小大约为68kDa。5、致鹅卵黄性腹膜炎性大肠杆菌外膜蛋白的鉴定为了研究致鹅卵黄性腹膜炎性大肠杆菌与其它大肠杆菌在外膜蛋白表达上的异同,分别提取了5株致鹅卵黄性腹膜炎性大肠杆菌和2株从鸡分离的大肠杆菌的外膜蛋白,通过SDS-PAGE和Western-blotting试验（抗鹅卵黄性腹膜炎性大肠杆菌的血清）研究发现致鹅卵黄性腹膜炎性大肠杆菌E0238、E0239均有一条约68kDa的蛋白条带。将这一特异蛋白条带从SDS-PAGE凝胶中切取后,进行MALDI-TOF质谱分析,获得的肽质量指纹谱（PMF）数据经MASCOT检索引擎查询NCBI蛋白数据库。结果表明,分离的蛋白质中存在两种蛋白,即维生素B12受体蛋白和鞭毛蛋白,二者在致鹅卵黄性腹膜炎性过程中的具体作用有待于进一步研究。
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