核桃属两种植物内生真菌次生代谢产物的抑菌活性研究Ⅰ

论文摘要

本文以核桃属两种植物核桃和黑核桃为研究对象,针对其茎、叶、果实等不同组织的内生真菌进行了分离和纯化,分别得到29株和31株（共60株）内生真菌。从分布来看,核桃与黑核桃不同部位所获得的内生真菌数量不尽相同,但分布趋势一致,均为茎部>果实部>叶部。在分离纯化的60株内生真菌中,核桃与黑核桃茎部分别得到15株和12株,分别占各自总数的51.7%和38.7%;果实部分别得到9株和10株,分别占各自总数的31%和32.3%;叶部分别得到5株和9株,分别占各自总数的17.2%和29%。将从黑核桃中分离的内生真菌进行了鉴定,初步鉴定出其中的14株,归属于3目3科3属,其中链格孢属（Alternatia sp.）为优势种群。以5种植物病原真菌为测试菌种,对60株核桃和黑核桃内生真菌发酵液进行抑菌活性筛选。从黑核桃茎部分离的菌株HJ1的发酵液对5种植物病原真菌的抑制作用都超过了40%,其中对油菜菌核病原菌和棉花立枯病原菌的抑制率分别为73.41%和100%,确定HJ1为活性筛选试验的目的菌种。黑核桃内生真菌HJ1发酵液稳定性测试结果显示:抑菌活性成分在80℃以下具有较好的热稳定性;pH的升高或降低对抑制效果有一定的影响,当pH升高至11时,抑菌效果下降十分明显,抑菌活性成分的酸稳定性比碱稳定性好。对黑核桃内生真菌HJ1发酵液萃取物进行了活性研究,结果表明:HJ1发酵产物不同萃取相对10种植物病原真菌的抑制活性大小是:乙酸乙酯相>正丁醇相>萃余水相。乙酸乙酯萃取物对10种植物病原真菌的抑制率都在50%以上;对3种细菌都有不同程度的抑制作用,其中对枯草芽孢杆菌表现为抗药性,这说明HJ1发酵产物抑菌活性物质主要集中在乙酸乙酯相。HJ1发酵产物的乙酸乙酯萃取物不同浓度对10种植物病原真菌都有不同程度的抑制作用,在α=0.05水平上各组间均值方差分析和组间均值多重比较均具有显著性差异,总体来说高浓度的抑制效果好于低浓度。对具有活性的菌株HJ1进行液体发酵,提取其次生代谢产物乙酸乙酯萃取粗品（50g）。在活性跟踪的指导下,运用硅胶柱层析、SephadexLH-20柱层析及重结晶等分离纯化手段对活性成分进行分离纯化,共分离得到3个化合物,通过理化性质分析和光谱分析（MS和NMR）,最终确定了其中1个化合物的结构:5α,8α-环二氧麦角甾-6,22-二烯-3β-醇。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 内生真菌研究现状
• 1.1.1 内生菌的定义
• 1.1.2 内生菌的分类
• 1.1.3 内生真菌的起源和演化
• 1.1.4 内生真菌生物学及生态学特点
• 1.1.5 内生真菌的生物学和生态学作用
• 1.1.6 内生真菌代谢产物的研究
• 1.1.7 内生真菌产生与宿主相同或相似成分机制的探索
• 1.1.8 我国内生真菌研究概况
• 1.1.9 内生真菌研究存在的问题与展望
• 1.2 核桃属植物次生代谢物及其生物活性
• 1.2.1 核桃的次生代谢物及其生物活性
• 1.2.2 黑核桃的次生代谢物及其生物活性
• 1.3 研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物样品来源
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 抑菌试验测试菌株
• 2.1.4 试剂及仪器
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 核桃、黑核桃内生真菌的分离纯化
• 2.2.2 黑核桃内生真菌的初步鉴定
• 2.2.3 核桃、黑核桃内生真菌发酵液的抑菌活性筛选
• 2.2.4 活性菌株发酵液稳定性的测试
• 2.2.5 活性菌株代谢产物抑菌活性测定
• 2.2.6 活性内生真菌菌株代谢产物中活性物质的提取分离
• 2.2.7 化合物的纯度检验
• 2.2.8 活性内生真菌次生代谢产物的结构鉴定
• 第三章 结果与分析
• 3.1 核桃、黑核桃内生真菌的分离纯化结果
• 3.1.1 表面消毒效果的检查
• 3.1.2 核桃、黑核桃内生真菌的分离结果
• 3.2 黑核桃内生真菌的鉴定结果
• 3.3 核桃、黑核桃内生真菌代谢产物的抑菌活性筛选结果
• 3.3.1 核桃内生真菌代谢产物的抑菌活性筛选结果
• 3.3.2 黑核桃内生真菌代谢产物的抑菌活性筛选结果
• 3.3.3 核桃、黑核桃内生真菌代谢产物的抑菌活性筛选结果总结比较
• 1 发酵液稳定性的测试结果'>3.4 黑核桃内生真菌HJ₁发酵液稳定性的测试结果
• 1 发酵液抑菌活性的影响'>3.4.1 温度对黑核桃内生真菌HJ₁发酵液抑菌活性的影响
• 1 发酵液抑菌活性的影响'>3.4.2 pH 对黑核桃内生真菌HJ₁发酵液抑菌活性的影响
• 1 代谢产物抑菌活性测定结果'>3.5 黑核桃内生真菌HJ₁代谢产物抑菌活性测定结果
• 1 代谢产物不同萃取相的筛选'>3.5.1 黑核桃内生真菌HJ₁代谢产物不同萃取相的筛选
• 3.5.2 乙酸乙酯萃取相对10 种病原真菌的活性测试结果
• 3.5.3 乙酸乙酯萃取相对细菌的抑制作用
• 1 代谢产物活性成分的提取分离'>3.6 黑核桃内生真菌HJ₁代谢产物活性成分的提取分离
• 3.6.1 乙酸乙酯萃取相的提取分离
• 3.6.2 不同洗脱梯度的抑菌活性测试
• 3.6.3 组分Fr.4 和Fr.5 的分离纯化
• 3.7 化合物的纯度检验
• 1 代谢产物的结构鉴定'>3.8 黑核桃内生真菌HJ₁代谢产物的结构鉴定
• 3.8.1 化合物1 的理化性质
• 3.8.2 化合物1 的结构解析
• 3.8.3 化合物2、3 的物理性质
• 第四章 结论与讨论
• 4.1 结论
• 4.2 讨论
• 4.2.1 表面消毒效果的检查
• 4.2.2 内生真菌的分离纯化技术
• 4.2.3 内生真菌的菌种鉴定
• 4.2.4 内生真菌的活性筛选
• 4.2.5 内生真菌代谢产物研究
• 4.2.6 内生真菌的展望
• 4.3 下一步的工作
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 作者简介