论文摘要
【目的】1.分离、扩增和纯化人骨髓间充质干细胞（BMSCs）和人软骨细胞。2.构建慢病毒载体,将SOX5、6、9和Chondromodulin-I基因转染人骨髓间充质干细胞。【方法】1.分离、扩增和纯化BMSCs和人软骨细胞的实验:从复旦大学附属中山医院骨科接受脊柱或骨盆手术的20-50岁患者（男女不限）废弃的胸椎、腰椎椎体或髂骨中提取3-5 ml骨髓,经密度梯度离心法分离出单个核细胞,通过黏附贴壁筛选及传代扩增,经流式细胞仪鉴定细胞表面相对特异性分子（CD29、CD105和CD166）阳性率以明确BMSCs的纯度。利用复旦大学附属耳鼻喉科医院20-40岁接受鼻中隔软骨切除手术的患者（男女不限）废弃的鼻中隔软骨分离软骨细胞、体外培养扩增,分别用常规培养剂和添加生长因子（TGF-β110ng/ml,IGF-1 50ng/ml,Dex 40ng/ml）进行体外培养、扩增,通过形态观察、生长曲线描绘,并经免疫荧光、RT-PCR方法检测软骨特异性标志物,观察其间的差别。2.慢病毒载体构建的实验和慢病毒转染BMSCs实验:利用已提取的SOX5,6,9基因质粒和克隆的Chondromodulin-I cDNA,包装构建慢病毒载体,将构建好的融合蛋白表达载体转染目的细胞（人BMSCs）,通过荧光显微镜观察融合蛋白GFP、western blot、免疫荧光、RT-PCR等检测方法检测过表达基因的表达情况,以明确转染效果,为进一步研究做准备。【结果】1.分离、扩增和纯化人骨髓间充质干细胞和人软骨细胞的实验:经密度梯度离心法分离的人骨髓单个核细胞扩增至第5代时,通过流式细胞仪检测细胞表面相对特异性分子阳性表达率,CD29为98.5%,CDl05为97%,CD166为94.8%,提示分离、扩增和纯化人骨髓间充质干细胞效果满意。软骨细胞经体外培养结果提示,培养至第3代,无论是否添加生长因子,细胞外形无明显差异,但添加生长因子组的软骨细胞生长速度明显加快,经免疫荧光方法,RT-PCR行软骨特异性标志物表型鉴定表达呈阳性结果,可敷进一步实验之需。2.慢病毒载体构建的实验和慢病毒转染BMSCs实验:已提取的SOX5、6、9基因质粒和chm-I基因cDNA,成功包装至慢病毒（lentivirus）载体。以慢病毒为载体,成功将SOX5、6、9和chondromodulin-I基因导入人骨髓间充质干细胞。经荧光显微镜观察可见所携带的标记物,western blot检测提示过表达基因蛋白表达阳性,免疫荧光检测转染率结果chm-I为100%,SOX5为90%以上（SOX6和SOX9因细胞数量不足,需要重新测定）,RT-PCR行转染目的基因chm-I鉴定表达呈阳性结果,提示目的基因成功转染至目的细胞。【结论】1.经适当培养方法可以获取相当纯度的人BMSCs和人软骨细胞。2.SOX-5、6、9和Chondromodulin-I基因成功包装至慢病毒载体。以慢病毒为载体,可以转染人骨髓间充质干细胞,过表达基因可长期表达。
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