论文摘要
目的建立具有自身免疫特性的甲状腺相关眼病（TAO）体外复合培养的细胞模型,通过动态观察和定量测定其炎性因子的表达,以证明眼眶成纤维细胞（OFs）在T淋巴细胞介导下的炎性病变,再应用特异性环氧化酶-2（COX-2）抑制剂调控炎性反应,从而探讨甲状腺相关眼病细胞学和分子生物学的发病机制,为临床治疗提供新的思路。方法原代培养10例TAO患者及10例正常人的眼眶成纤维细胞,免疫组化法鉴定其性质;尼龙毛吸附+初期固相包被抗体刺激+细胞培养淘汰法纯化、培养20例TAO患者及20例正常人的外周血T淋巴细胞,流式细胞术鉴定其纯度及性质;复合培养后荧光免疫鉴定其性质,透射电镜观察比较其超微结构;ELISA法比较各组培养细胞模型24h、48h、72h炎性细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-2及IL-6的表达;实时荧光定量PCR检测各组炎性基因COX-2的表达;所有非自身T淋巴细胞与OFs复合培养的细胞模型,同自身T淋巴细胞与OFs复合培养的细胞模型相同步骤完成以上实验。MTT法比较不同浓度及不同作用时间塞来昔布对复合培养细胞模型中眼眶成纤维细胞增殖的抑制作用;ELISA法比较塞来昔布对各组复合培养细胞模型炎性细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-2及IL-6表达的抑制作用。结果1)体外成功培养了眼眶成纤维细胞及外周血T淋巴细胞,建立了TAO复合培养模型;免疫荧光、电镜等未见OFs与自身T淋巴细胞复合培养的细胞模型和OFs与非自身T淋巴细胞复合培养细胞模型有明显形态结构等差别。2)24h复合培养各实验组的IL-1α、IL-1β、IL-2及IL-6的表达均升高,其中T+T组（甲状腺相关眼病患者的T淋巴细胞与患者的眼眶成纤维细胞复合培养组）的IL-1α、IL-1β、IL-2水平升高的最高,与其他各组之间的差异有统计学意义（P=0.001,0.008,0.012）;24h时N+N组（正常人的T淋巴细胞与正常人的眼眶成纤维细胞复合培养组）的IL-6水平最高,至72h时N+T组（正常人的T淋巴细胞与甲状腺相关眼病的眼眶成纤维细胞复合培养组）IL-6水平最高,24h、48h、72h各组之间的IL-6浓度差异有统计学意义（P=0.000,0.004,0.001）;无论OFs与自身还是非自身T淋巴细胞复合培养的细胞模型,其四种炎性细胞因子的合成及变化均一致。3)TAO患者的OFs COX-2表达量较正常人的高,复合培养细胞模型中T+T组COX-2表达量最高。4)塞来昔布浓度为1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L及10μmol/L时对各组OFs均有不等的增殖抑制作用。在一定范围内,随着浓度增加、时间延长,增殖抑制率也增加。5)浓度为2μmol/L的塞来昔布作用各组复合培养细胞模型12h后,IL-1α、IL-1β、IL-2及IL-6的表达水平均不同程度地下降,随着时间的延长,各组IL-1α、IL-1β、IL-2及IL-6的表达水平不断降低。其中12h、24h、36h T+T组IL-1β、IL-2及IL-6的浓度与其他组的浓度差异均有统计学意义（P=0.001,0.008,0.001;0.000,0.002,0.012:0.006,0.012,0.000）。结论本课题在国内首次尝试建立了具有自身免疫特性的TAO体外复合培养细胞模型。无论是TAO患者还是正常人眼眶成纤维细胞和外周血T淋巴细胞复合培养的细胞模型在光镜水平上形态学无明显差异,但超微结构可见代谢增强的改变,T+T组尤为明显。所有组复合培养的细胞模型上清液中均可检测到炎性因子IL-1α、IL-1β、IL-2及IL-6的表达,细胞模型的OFs均可检测到COX-2 mRNA的表达,除IL-6外,均为T+T组最显著。这些代谢增强,炎性因子及炎性反应基因表达的增高均证明了TAO患者的T淋巴细胞有较强的介导炎症反应的活性,复合培养细胞模型显示了明显的自身免疫特性。作为靶向调控应用选择性COX-2抑制剂塞来昔布后,各组的IL-1α、IL-1β、IL-2及IL-6的表达水平均不同程度下降,除IL-6外均为T+T组最明显,证明了这种自身免疫炎症反应的可调控性。另一方面也说明了复合培养细胞模型不仅对于研究T淋巴细胞与OFs的相互作用有重要意义,而且也提供了TAO的自身免疫疾病发病机制的直接证据,为探讨更广泛的临床治疗途径,特别是抗炎药物、T细胞抑制剂、细胞因子拮抗剂等的治疗开辟了新的思路。
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标签：复合培养细胞模型论文; 甲状腺相关眼病论文; 炎性细胞因子论文; 环氧化酶论文; 塞来昔布论文;