鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌二联多价蜂胶疫苗的研制及其免疫应答反应的动态研究

论文摘要

鸭疫里默氏杆菌感染和大肠杆菌病在临床上常以混合感染的形式出现，死亡率高，饲料转化率低，治疗代价高，给养鸭业造成极大的经济损失。本试验采用四川地区鸭疫里默氏杆菌（RA）优势菌株(B18、B112、B115)和禽大肠杆菌（E-Coli）常见标准血清型(O1、O2、O18、O78)成功研制了鸭疫里默氏杆菌、大肠杆菌二联多价蜂胶灭活疫苗，通过筛选确定了该疫苗的最佳免疫剂量为疫苗中每株菌的含量达到1×109CFU／mL，0．5mL／只，4℃可保存10个月以上，免疫鸭首免后7d RA和E-Coli的攻毒保护率分别为60％和50％，二免后7d RA和E-Coli的攻毒保护率分别为90％和70％。本实验通过淋巴细胞转化试验（MTT比色法）研究细胞免疫，间接ELISA检测免疫鸭外周血抗体水平，从而评价RA、E-Coli二联蜂胶疫苗在鸭体内免疫应答的动态反应性。MTT比色法（采用含10％小牛血清和5μg／mL ConA的RPMI-1640于39℃培养66h）结果显示首免后3d、6d、9d和13d免疫组的淋巴细胞转化效果均显著（P<0．05）或极显著（P<0．01）高于对照组，于首免后6d达到峰值。2次免疫组高于1次免疫组，但差异不显著（P>0．05）；首免后20d和27d 1次免疫组和2次免疫组与对照组相比均差异不显著（P>0．05）。由此可见，蜂胶疫苗可极显著地增强免疫鸭血液中的T淋巴细胞转化效果，但这种增强作用是短暂的，维持时间不到3周。抗体水平检测于首免后3d、6d、9d、13d、20d、27d、34d、41d、48d、55d和69d进行。用单株菌的超声波裂解抗原包被酶标板测定其在免疫鸭体内抗体水平的动态反应性，结果显示雏鸭免疫后3d即可产生免疫力，RA和E-Coli共7株菌的抗体水平均随着时间的延长逐渐升高，2次免疫组的抗体水平从第13d开始显著（P<0．05）高于1次免疫组，并在20d左右达到峰值，这种高抗体水平维持至免疫后第48d，之后逐渐下降，1次免疫组和2次免疫组第69d的抗体水平均高于同组免疫后第13d的抗体水平。本试验建立的检测RA抗体的间接ELISA比间接血凝试验（IHT）敏感50-200倍，检测E-Coli抗体的间接ELISA比IHT敏感25-100倍。本研究表明，RA、E-Coli二联多价蜂胶灭活疫苗安全、有效、无副作用，能够刺激机体产生细胞免疫和体液免疫应答。本研究为鸭疫里默氏杆菌感染和大肠杆菌病的免疫发病机制、免疫预防、免疫治疗提供了重要参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 鸭疫里默氏杆菌研究概况
• 1.2 禽大肠杆菌研究概况
• 1.3 兽用疫苗的研究概况
• 1.3.1 兽用疫苗的种类
• 1.3.2 免疫佐剂
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 试验菌株
• 2.1.2 试验动物
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 其它试验材料
• 2.2 试验仪器
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 菌液制备和检验
• 2.3.2 生产种子菌液毒力测定
• 2.3.3 RA、E-Coli二联多价蜂胶疫苗的合成
• 2.3.4 最佳免疫剂量的选择
• 2.3.5 疫苗保存期测定
• 2.3.6 疫苗接种与攻毒保护试验
• 2.3.7 淋巴细胞转化试验（MTT比色法）
• 2.3.8 间接ELISA法检测免疫鸭外周血抗体水平
• 2.3.9 间接血凝试验（IHT）
• 3 结果
• 3.1 生产用种子菌液毒力测定
• 3.2 疫苗最佳免疫剂量选择
• 3.3 疫苗保存期测定
• 3.4 疫苗的攻毒保护试验
• 3.5 淋巴细胞转化试验
• 3.6 间接ELISA试验
• 3.6.1 ELISA裂解抗原的蛋白含量
• 3.6.2 最佳抗原包被浓度选择
• 3.6.3 HRP-羊抗鸭IgG最佳工作浓度选择
• 3.6.4 判定结果的确立
• 3.6.5 特异性试验
• 3.6.6 重复性试验
• 3.6.7 ELISA检测免疫鸭外周血抗体水平
• 3.7 IHT与间接ELISA的敏感性比较
• 4 讨论
• 4.1 关于RA、E-Coli二联多价蜂胶疫苗
• 4.1.1 疫苗及其攻毒保护率
• 4.1.2 疫苗的最佳免疫剂量
• 4.2 关于细胞免疫应答的动态反应性
• 4.3 关于体液免疫应答的动态反应性
• 4.3.1 间接ELISA方法的建立
• 4.3.2 免疫鸭抗体水平动态变化
• 5 小结
• 参考文献
• 致谢
• 试剂配制
• 硕士学位期间发表的学术论文