论文摘要
(Ⅰ)Poly（A）几乎存在于所有真核生物的mRNA3’端,并且影响着mRNA几乎所有的代谢活动:转运、翻译和降解。目前在哺乳动物细胞中发现有两种不同的Poly（A）结合蛋白,它们分别是细胞质中的PABPC和细胞核中的PABPN1。PABPC存在于所有的真核生物中,具有起始翻泽和调控RNA降解的功能。在其N端具备四段高度保守的RRM（亦称为RBD）,RRM1和RRM2分别与RRM3和RRM4非常类似,前两个RRM是主要的用于特异性结合poly（A）的区域。在人PABPC（RRM1/RRM2）和oligo（A）复合物晶体结构中,β-sheet形成的平台结合了一个处于伸展状态构象的寡聚核苷酸,每个RRM大约结合了4个核苷酸。PABPN1（曾被命名为PABP2、PABⅡ）是目前在哺乳动物中发现的唯一存在于细胞核内的poly（A）结合蛋白,它可以通过刺激poly（A）合成酶活性来促进poly（A）的合成,控制poly（A）尾巴的长度。在生理条件下,该蛋白始终处于单体、二聚体和多聚体的动态平衡之中,这是其发挥功能的重要环节。PABPN1-poly（A）复合物可以形成球形颗粒和线形状态,并且在两者之间有动态平衡。这种动态的结构很可能是作为一种分子标尺来决定poly（A）的长度。PABPN1酸性的N-端domain是促进poly（A）合成酶活性必不可少的,C-端的富含Arg的区域和中部的RRM共同用来结合poly（A）,但只有RRM具有特异性结合的能力。虽然PABPN1结合poly（A）的能力与PABPC相当,但前者只含有一个高度保守的RRM结构域。从一级结构比较来看,PABPN1-RRM与目前已知结构的RRM同源性非常低,包括PABPC的RRMs。我们通过原核表达得到人PABPN1-RRM结构域并进行晶休生长,在同一条件下（同一液滴中）同时获得了两种不同空间群的晶体,我们分别解析了它们的结构。第一个结构利用单波长散射方法解析了2.0（?）分辨率的晶体,该晶体属于123空间群,晶胞参数分别为:a=b=c=92.35（?）,最后的结构修正参数为:R因子17.4%,Rfree 20.7%。第二个结构利用分子置换方法解析了2.82（?）分辨率的晶体,该晶体属于P31空间群,晶胞参数分别为:a=b=59.34（?）,c=80.60（?）;γ=120.00°,最后的结构修正参数为:R因子22.6%,Rfree 29.0%。PABPN1-RRM具有典型的RRM的αβ—sandwich空间结构:β1α1β2β3α2β4;面向β-sheet从左向右依次为β4β1β3β2形成了一个β-sheet的平面,在其后方有两个接近90°的α-helix。但与其他RRM比较,我们发现有两个特点使得PABPN1 RRM有着显著的不同:loop3的走向和二聚化作用。（Ⅱ）5-氨基酮戊酸（5-aminolevulinic acid,ALA）是四碳合成途径当中首要的供体,植物,藻类和一些细菌也可以通过五碳途径从谷氨酸合成5-氨基酮戊酸。在这个途径中一系列的酶发挥着重要的作用,谷氨酸-1-半醛转氨酶（Glutamate-1-semialdehyde aminotransferase,GSA-AT）是这个途径的最后一个酶。其他两个重要的酶是谷氨酸-tRNA合成酶和谷氨酸-tRNA还原酶。我们从基因组文库中克隆了GSA-AT的CDS序列,并构建了GSA-AT-p28a质粒。重组蛋白GSA-AT-HisTag在E.coli BL21（DE3）中表达量很高,用Ni亲和柱纯化后纯度达到95%以上。蛋白质在浓缩和脱盐过程中比较稳定,动态光散射实验证实重组蛋白是以单体的形式存在。用悬滴气相扩散法经过筛选和优化得到了GSA-AT的晶体。晶体的衍射分辨率为2.3（?）并完成了晶体衍射数据的收集,晶体空间群为C2,晶胞参数为a=109.25（?）,b=55.76（?）,c=80.50（?）,α=γ=90.00°,β=132.02°。一个晶体学不对称单位含有一个蛋白质分子。用分子置换法已获得结构的初相位,最后的结构修正参数为:R因子19.3%,Rfree 23.4%。通过对GSA-AT三维空间结构分析,该分子单体分别由N末端domain（约65个氨基酸形成的两段α螺旋和三段反向的β片组成）、辅基结合区（65-320,包括一个由7段β-sheet组成的核心）和C末端domain（321-430,两段反向β折叠片和四段α螺旋）组成。我们解析的结构能够清晰的获得活性loop区（148-179）的三维走向以及辅基FMN的具体定位。