新型Bcr-Abl和Src/Abl抑制剂抗慢性髓性白血病的实验研究

论文摘要

慢性髓性白血病（chronic myelogenous leukemia,CML）是一种血液系统恶性增生性疾病。以细胞内出现嵌合蛋白Bcr-Abl为主要特征。Bcr-Abl蛋白具有持续活化的酪氨酸激酶活性,激活下游多条信号传导通路,引起疾病的发生。伊马替尼（Imatinib,Gleevec,STI-571）属一种Abl酪氨酸激酶抑制剂,它是第一个小分子靶向性治疗药物。体内、外实验表明,Imatinib通过抑制Bcr-Abl自身磷酸化和底物磷酸化,而抑制细胞增殖和诱导凋亡。Imatinib在临床上用于费城染色体阳性（Philadelphia chromosome positive,Ph+）的CML患者。由于其所产生的较好血液学和细胞遗传学缓解（尤其是慢性期CML患者）,Imatinib已经作为新近诊断的CML患者的一线药物。但是Imatinib在治疗CML急变期及Ph+的急性淋巴细胞白血病患者时效果却并不理想,而且随着临床的用药,Imatinib逐渐出现耐药。因此,这促使人们寻找新的治疗CML和Imatinib耐药的CML的药物。AMN107属第二代Abl抑制剂,许多临床前研究结果已经显示出非常好的效果。研究表明,在许多Bcr-Abl转化的造血细胞系,AMN107对Bcr-Abl自身磷酸化和增殖的抑制较Imatinib高20-50倍。而且AMN107对很多Imatinib耐药的Bcr-Abl蛋白突变株有很强的抑制作用。目前AMN107正在进行临床试验,但已有些病例出现AMN107耐药,其机制是否与Imatinib耐药相同还在进一步研究中,因此Novartis制药公司又继续研发更强的Abl抑制剂,其中368485就是Novartis制药公司研制的一种新型此类化合物,其药物活性尚没有相关报道。本研究就是探讨一种新型苯胺嘧啶类衍生物FAB107在体内、外对CML细胞系K562细胞和K562耐Imatinib细胞系K562/G3.0的抑制作用。本研究采用MTT方法观察了FAB107与Imatinib和368485相比较对K562和K562/G3.0细胞的生长抑制作用。研究结果表明,FAB107抑制K562和K562/G3.0细胞生长,IC50分别为0.03μmol/L和0.07μmol/L。FAB107对2种细胞的抑制作用强于Imatinib(IC50分别为0.31μmol/L和6.32μmol/L),而与368485(IC50分别为0.02μmol/L和0.082μmol/L)相当。裸鼠中空纤维模型实验进一步证实,FAB107可以抑制K562和K562/G3.0细胞在裸鼠体内的生长。给药7天后,与对照组相比,FAB107的3个剂量组（15μmol/kg、30μmol/kg和45μmol/kg）在体内对K562及K562/G3.0细胞生长均呈剂量依赖性的抑制作用（P＜0.01）,并且抑制强度强于等摩尔浓度的Imatinib,与等摩尔浓度的368485相当。流式细胞术结果表明,FAB107可以剂量依赖性地诱导K562和K562/G3.0细胞凋亡,与等摩尔浓度的368485相当。为了阐明FAB107对K562和K562/G3.0细胞生长抑制作用的机制,我们检测了FAB107对K562和K562/G3.0细胞Bcr-Abl蛋白自身磷酸化的抑制作用。FAB107可以明显抑制K562和K562/G3.0细胞Bcr-Abl蛋白自身磷酸化。其作用优于等摩尔浓度的Imatinib,与等摩尔浓度的368485相当。总而言之,新型苯胺嘧啶类衍生物FAB107在体内外可以明显抑制K562和K562/G3.0细胞的生长,其作用机制可能与抑制Bcr-Abl蛋白自身磷酸化有关。上述研究提示,FAB107将是治疗Imatinib敏感和耐药的CML的较好候选化合物。慢性髓系白血病（chronic myelogenous leukemia,CML）是一种多能造血干细胞恶性克隆增殖性疾病,其恶性克隆标志是费城染色体（Philadelphia chromosome,Ph）及Bcr-Abl融合基因。后者编码产生的Bcr-Abl融合蛋白,即P210Bcr-Abl蛋白,具有异常增高的蛋白酪氨酸激酶（proteinty rosineki nase,PTK）活性,被认为是导致CML发病的根本原因。Imatinib（又称Gleevec,STI-571）是Bcr-Abl的抑制剂。该药用于CML的治疗以来,取得了显著的临床疗效。但随着它的广泛应用,人们发现部分患者对Imatinib存在原发或继发耐药。如此高度靶向性治疗药物如同其它抗肿瘤化疗药物一样,很快出现了耐药现象,这引起了人们的关注,并成为CML研究的又一热点。目前,关于Imatinib耐药的机制仍不完全清楚,主要包括以下几个观点:首先是血浆蛋白结合;第二是药泵;第三是BCR-ABL激酶突变;第四为不依赖BCR-ABL的耐药机制,如SRC家族;第五为基因扩增。Src激酶参与了Bcr-Abl介导的白血病的发生,并与一些Imatinib耐药病例有关。Dasatinib（Bristol-Myers Squibb,布迈-施贵宝）属噻唑类Src/Abl双靶点抑制剂。2006年6月已通过美国FDA批准上市,用于包括慢性、加速期、原发粒细胞性、原发淋巴细胞性白血病以及耐药的白血病病例（如对Imatinib耐药）在内的各类成人白血病的治疗。本研究试图在体外建立Imatinib耐药CML细胞系,并对其耐药机制进行初步探讨。同时探讨一种新型噻唑类衍生物FB2在体内外对K562细胞和K562耐Imatinib细胞系K562/G5.0的生长抑制作用及其作用机制。一、Imatinib耐药株K562/G5.0细胞系的建立和鉴定采用逐步递增药物浓度的方法培养K562细胞,进行耐药细胞的诱导;采用MTT法检测不同浓度Imatinib对K562和K562/G5.0的细胞毒作用;采用流式细胞术分析K562和K562/G5.0的细胞周期;MTT法检测阿霉素（doxorubicin）对两种细胞的细胞毒作用;测序分析Abl酪氨酸激酶ATP结合区基因点突变;MTT法检测Dasatinib对两种细胞的抑制作用;RT-PCR法检测K562和K562/G5.0细胞LynmRNA的表达;Western blot法检测K562、K562/G3.0和K562/G5.0细胞的C-Abl、P-C-Abl、Lyn和P-Lyn的表达;Western blot法检测Dasatinib对Lyn自身磷酸化的影响。研究结果表明,MTT法检测了Imatinib对K562和K562/G5.0的半数抑制浓度(50%inhibiting concentration,IC50)分别为0.37μmol/L和44.40μmol/L,K562/G5.0的耐药倍数为122.5倍。细胞周期分析表明K562/G5.0耐药细胞中G0/G1期和G2/M期细胞均稍有减少,而S期细胞有所增加。RT-PCR结果表明,MDR-1和BCRP在耐药株中的mRNA表达与K562和KB/V相比都有明显下降,进一步用阿霉素处理两种细胞,发现阿霉素对两种细胞的细胞毒作用相当。Abl激酶ATP结合区基因测序结果表明,两者序列完全一致。进一步我们还发现,耐药株的Lyn mRNA表达水平增高,Lyn和P-Lyn的蛋白表达水平也增高,但是C-Abl和p-C-Abl表达水平下降。同时,我们发现Lyn和P-Lyn的蛋白表达水平随着耐药浓度的增加而增高,而C-Abl和p-C-Abl的表达水平在耐药浓度低的细胞（K562/G3.0）中表达增高,而在耐药浓度高的细胞（K562/G5.0）中表达降低,Src/Abl双靶点抑制剂Dasatinib对K562/G5.0仍具有非常强的抑制作用。二、FB2在体内外对CML和Imatinib耐药的CML细胞的生长抑制作用MTT法检测FB2对K562和K562/G5.0细胞的生长抑制作用;MTT法检测FB2对MDA-MB-231和DU145细胞的生长抑制作用;采用Western blot法检测FB2对K562和K562/G5.0的C-Abl、Lyn和C-Src自身磷酸化水平的抑制作用;采用荷人CML的Imatinib耐药株K562/G5.0细胞的NOD/SCID小鼠,观察FB2对其生存期的影响。研究结果表明,MTT法检测了FB2对K562、K562/G01和K562/G5.0的IC50分别为0.03nmol/L、0.10nmol/L和0.38nmol/L。FB2还可以抑制其它上皮来源的实体肿瘤细胞MDA-MB-231和DU145细胞的生长。FB2可以明显抑制C-Abl、C-Src和Lyn蛋白的自身磷酸化。FB2还可以延长荷CML的Imatinib耐药株K562/G5.0细胞的NOD/SCID小鼠的生存期。总之,本研究在体外成功地建立起Imatinib耐药的K562细胞系,K562/G5.0,耐药浓度为5μmol/L,耐药倍数为122.5倍。K562/G5.0细胞的耐药机制属Bcr-Abl非依赖性,与Lyn激酶过度表达和激活有关。FB2作为一种新型Src/Abl双激酶抑制剂,可能成为治疗CML、Imatinib耐药的CML以及Src激酶过表达的肿瘤的较好候选化合物。

论文目录

• 英文缩略词（Abbreviations）
• 第一部分:新型苯胺嘧啶类化合物FAB107抗慢性髓性白血病的实验研究
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 实验结果
• 一、FAB107对K562和K562/G3.0细胞增殖的影响
• 二、FAB107对K562和K562/G3.0细胞凋亡的影响
• 三、FAB107对K562和K562/G3.0细胞Bcr-Ab1蛋白表达及磷酸化的影响
• 四、FAB107在裸鼠体内移植中空纤维模型对K562及K562/G3.0细胞增殖的抑制作用
• 结论
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分:新型Src/Ab1双靶点抑制剂FB2抗慢性髓系白血病的实验研究
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 实验材料
• 实验方法
• 结果（一）
• 一、K562/G5.0细胞的生物学性能分析
• 1.MTT法检测Imatinib对K562和K562/G5.0细胞生长抑制作用
• 2.K562和K562/G5.0细胞周期分析
• 二、K562/G5.0细胞耐药机制研究
• 1.MTT法检测Doxorubicin对K562和K562/G5.0的细胞毒作用
• 2.MDR1和BCRP的表达
• 3.MTT法检测Dasatinib对K562和K562/G5.0的细胞生长抑制作用
• 4.Lyn及其蛋白产物在K562和K562/G5.0细胞中的表达
• 5.Lyn在K562、K562/G3.0、K562/G5.0中的蛋白表达
• 6.Dasatinib对K562和K562/G5.0细胞Lyn蛋白磷酸化的影响
• 7.Ab1激酶ATP结合区基因测序分析
• 结论（一）
• 讨论（一）
• 结果（二）
• 一、FB2对肿瘤细胞增殖的影响
• 二、FB2对K562、K562/G5.0和K562/G01细胞c-Ab1、c-Src和Lyn自身磷酸化的影响
• 三、FB2对荷K562/G5.0细胞的NOD/SCID小鼠生存期的影响
• 结论（二）
• 讨论（二）
• 参考文献
• 综述（一）:以SRC家族激酶为分子靶点的肿瘤治疗
• 综述（二）:克服慢性粒细胞白血病治疗药伊马替尼耐药的新策略
• 致谢
• 个人简历